Alzheimerssjúkdómur (AD) skortir próteinlífmerki sem endurspegla margþætta undirliggjandi meinalífeðlisfræði hans, sem hindrar framgang greiningar og meðferðar. Hér notum við alhliða próteinfræði til að bera kennsl á heila- og mænuvökva (CSF) lífmerki sem tákna breitt svið AD meinalífeðlisfræði. Margþætt massagreining greindi um það bil 3.500 og um það bil 12.000 prótein í AD CSF og heilanum, í sömu röð. Netgreiningin á heilapróteininu leysti úr 44 líffræðilegum fjölbreytileikaeiningum, þar af 15 skarast við próteinið í heila- og mænuvökva. CSF AD merkin í þessum skarast einingum eru brotin í fimm próteinhópa, sem tákna mismunandi meinalífeðlisfræðilega ferla. Taugamótin og umbrotsefnin í AD heilanum minnka, en CSF eykst, en glial-ríkur merg- og ónæmishópar í heila og CSF aukast. Samkvæmni og sjúkdómssérhæfni breytinganna á pallborðinu var staðfest í meira en 500 sýnum til viðbótar CSF. Þessir hópar greindu einnig líffræðilega undirhópa í einkennalausu AD. Á heildina litið eru þessar niðurstöður lofandi skref í átt að vefbundnum lífmerkjaverkfærum fyrir klíníska notkun í AD.
Alzheimerssjúkdómur (AD) er algengasta orsök taugahrörnunar heilabilunar um allan heim og einkennist af fjölmörgum truflunum á líffræðilegum kerfum, þar á meðal taugamótaflutningi, glialmiðlaðri ónæmi og umbrotum hvatbera (1-3). Hins vegar eru rótgrónir próteinlífvísar þess enn einbeittir að því að greina amyloid og tau prótein og geta því ekki endurspeglað þessa fjölbreyttu meinalífeðlisfræði. Þessir „kjarna“ próteinlífmerki sem eru áreiðanlegasta mæld í heila- og mænuvökva (CSF) eru meðal annars (i) amyloid beta peptíð 1-42 (Aβ1-42), sem endurspeglar myndun amyloid plaques í heilaberki; (ii) alger tau, merki um hrörnun axóns; (iii) fosfó-tau (p-tau), fulltrúi sjúklegrar tau offosfórunar (4-7). Þrátt fyrir að þessi lífvísar heila- og mænuvökva hafi auðveldað uppgötvun okkar á „merktum“ AD próteinsjúkdómum (4-7), þá tákna þeir aðeins lítinn hluta af flóknu líffræðinni á bak við sjúkdóminn.
Skortur á lífeðlisfræðilegum fjölbreytileika AD lífmerkja hefur leitt til margra áskorana, þar á meðal (i) vanhæfni til að bera kennsl á og mæla líffræðilega misleitni AD sjúklinga, (ii) ófullnægjandi mælingar á alvarleika og framvindu sjúkdómsins, sérstaklega á forklínísku stigi, Og ( iii) þróun lækningalyfja sem tókst ekki að leysa alla þætti taugasjúkdóma. Að treysta á tímamótasjúkdóma til að lýsa AD frá skyldum sjúkdómum eykur aðeins þessi vandamál. Sífellt fleiri vísbendingar sýna að flestir aldraðir með heilabilun hafa fleiri en eitt sjúklegt einkenni vitrænnar hnignunar (8). Allt að 90% eða fleiri einstaklinga með AD meinafræði eru einnig með æðasjúkdóma, TDP-43 innifalið eða aðra hrörnunarsjúkdóma (9). Þessi háu hlutfall meinafræðilegrar skörunar hefur raskað núverandi greiningarramma okkar fyrir heilabilun og þörf er á ítarlegri meinalífeðlisfræðilegri skilgreiningu á sjúkdómnum.
Með hliðsjón af brýnni þörf fyrir margs konar AD lífmerki, er sviðið í auknum mæli að taka upp „omics“ aðferðina sem byggir á heildarkerfinu til að uppgötva lífmerki. Accelerated Pharmaceutical Partnership (AMP)-AD Alliance var hleypt af stokkunum árið 2014 og er í fararbroddi áætlunarinnar. Þetta þverfaglega átak Heilbrigðisstofnunar, háskóla og iðnaðar miðar að því að nota kerfisbundnar aðferðir til að skilgreina betur meinalífeðlisfræði AD og þróa greiningu og meðferðaraðferðir fyrir líffræðilegan fjölbreytileika (10). Sem hluti af þessu verkefni hefur netpróteomics orðið efnilegt tæki til framfara á kerfisbundnum lífmerkjum í AD. Þessi óhlutdræga gagnadrifna nálgun skipuleggur flókin próteinfræðigagnasett í hópa eða „einingar“ samtjáðra próteina sem tengjast ákveðnum frumugerðum, frumulíffærum og líffræðilegum aðgerðum (11-13). Tæplega 12 upplýsingaríkar netpróteinfræðirannsóknir hafa verið gerðar á AD heilanum (13-23). Á heildina litið benda þessar greiningar til þess að AD heilanetspróteinið viðheldur mjög varðveittu einingaskipulagi í sjálfstæðum árgöngum og mörgum heilabörksvæðum. Að auki sýna sumar þessara eininga endurtakanlegar breytingar á AD-tengdri gnægð í gagnasafni, sem endurspeglar meinalífeðlisfræði margra sjúkdóma. Samanlagt sýna þessar niðurstöður vænlegan akkerispunkt fyrir uppgötvun heilanetspróteómsins sem kerfisbundins lífmerkis í AD.
Til þess að umbreyta AD heilanetspróteininu í klínískt gagnlegt lífmerki sem byggir á kerfum, sameinuðum við heila-afleidda netið með próteingreiningu á AD CSF. Þessi samþætta nálgun leiddi til auðkenningar á fimm efnilegum settum af CSF lífmerkjum sem tengjast margs konar heila-tengdri meinafræði, þar á meðal taugamótum, æðum, mergmyndun, bólgu og truflun á efnaskiptaferlum. Við staðfestum þessar lífmerkjaspjöld með góðum árangri með mörgum afritunargreiningum, þar á meðal meira en 500 CSF sýni úr ýmsum taugahrörnunarsjúkdómum. Þessar staðfestingargreiningar fela í sér að skoða hópmarkmið í heila- og mænuvökva sjúklinga með einkennalausan AD (AsymAD) eða sýna vísbendingar um óeðlilega amyloid uppsöfnun í eðlilegu vitrænu umhverfi. Þessar greiningar undirstrika verulega líffræðilega misleitni í AsymAD þýðinu og bera kennsl á spjaldmerki sem gætu verið fær um að undirflokka einstaklinga á fyrstu stigum sjúkdómsins. Á heildina litið eru þessar niðurstöður lykilskref í þróun próteinalífmerkistækja sem byggjast á mörgum kerfum sem geta leyst með góðum árangri margar af klínísku áskorunum sem AD stendur frammi fyrir.
Megintilgangur þessarar rannsóknar er að bera kennsl á ný lífmerki í heila- og mænuvökva sem endurspegla ýmsa heila-tengda meinafræði sem leiða til AD. Mynd S1 útlistar rannsóknaraðferðafræði okkar, sem felur í sér (i) yfirgripsmikla greiningu knúin áfram af bráðabirgðaniðurstöðum AD CSF og netheilapróteinið til að bera kennsl á mörg heilatengd CSF sjúkdóms lífmerki, og (ii) síðari afritun Þessi lífmerki eru í nokkrum sjálfstæðum heila- og mænuvökva. vökvaárgangar. Uppgötvunarmiðaða rannsóknin hófst með greiningu á mismunatjáningu CSF hjá 20 vitræna heilbrigðum einstaklingum og 20 AD sjúklingum á Emory Goizueta Alzheimer sjúkdómsrannsóknarmiðstöðinni (ADRC). Greining á AD er skilgreind sem marktæk vitsmunaleg skerðing í viðurvist lágs Aβ1-42 og hækkaðs magns heildar tau og p-tau í heila- og mænuvökva [Mean Montreal Cognitive Assessment (MoCA), 13,8 ± 7,0] [ELISA (ELISA) )]] (tafla S1A). Viðmiðið (meðal MoCA, 26,7 ± 2,2) var með eðlilegt gildi CSF lífmerkja.
CSF manna einkennist af kraftmiklu úrvali próteinagnægðar, þar sem albúmín og önnur afar mikil prótein geta komið í veg fyrir greiningu próteina sem vekur áhuga (24). Til að auka dýpt próteinuppgötvunar, fjarlægðum við fyrstu 14 próteinin sem voru mjög mikið úr hverju CSF sýni fyrir massagreiningu (MS) greiningu (24). Alls greindust 39.805 peptíð með MS, sem voru kortlögð á 3691 prótein í 40 sýnum. Próteinmagngreining er framkvæmd með margfaldri tandem mass tag (TMT) merkingu (18, 25). Til að leysa þau gögn sem vantaði, tókum við aðeins inn þau prótein sem voru magngreind í að minnsta kosti 50% sýnanna í síðari greiningu, og mældum þannig að lokum 2875 próteóm. Vegna marktæks munar á heildarmagni próteina var viðmiðunarsýni tölfræðilega talið vera frávik (13) og var ekki tekið með í síðari greiningu. Mikið gildi hinna 39 sýnanna sem eftir voru voru leiðrétt eftir aldri, kyni og lotusamdreifni (13-15, 17, 18, 20, 26).
Með því að nota tölfræðilega t-prófsgreiningu til að meta mismunatjáningu á aðhvarfsgagnasettinu, greindi þessi greining prótein þar sem magnmagn þeirra var marktækt breytt (P <0,05) á milli viðmiðunar- og AD tilvika (tafla S2A). Eins og sést á mynd 1A minnkaði magn alls 225 próteina í AD marktækt og magn 303 próteina var marktækt aukið. Þessi prótein með mismunandi tjáningu innihalda nokkur áður auðkennd AD merki í heila- og mænuvökva, svo sem prótein tengt prótein tau (MAPT; P = 3,52 × 10−8), taugaþráður (NEFL; P = 6,56 × 10−3), vaxtartengt prótein 43 (GAP43; P = 1,46 × 10−5), fitusýrubindandi prótein 3 (FABP3; P = 2,00 × 10−5), Kítínasi 3 eins og 1 (CHI3L1; P = 4,44 × 10−6), taugakorn (NRGN; P = 3,43 × 10−4) og VGF taugavaxtarþáttur (VGF; P = 4,83 × 10−3) (4-6). Hins vegar greindum við einnig önnur mjög mikilvæg markmið, svo sem GDP dissociation inhibitor 1 (GDI1; P = 1,54 × 10-10) og SPARC-tengda mát kalsíumbindingu 1 (SMOC1; P = 6,93 × 10-9). Gene Ontology (GO) greining á 225 marktækt minni próteinum leiddi í ljós náin tengsl við líkamsvökvaferli eins og steraefnaskipti, blóðstorknun og hormónavirkni (Mynd 1B og Tafla S2B). Aftur á móti er verulega aukið prótein af 303 nátengt frumubyggingu og orkuefnaskiptum.
(A) Eldfjallalóðin sýnir log2-falda breytingu (x-ás) miðað við -log10 tölfræðilega P-gildi (y-ás) sem fæst með t-prófinu, sem er notað til að greina mismunatjáningu milli stjórnunar (CT) og AD tilvik CSF próteinsins Af öllum próteinum. Prótein með marktækt minnkað magn (P <0,05) í AD eru sýnd með bláu, en prótein með marktækt aukið magn í sjúkdómum eru sýnd með rauðu. Valið prótein er merkt. (B) Efstu GO hugtökin sem tengjast próteini eru verulega lækkuð (blá) og aukin (rauð) í AD. Sýnir GO hugtökin þrjú með hæstu z-stigunum á sviði líffræðilegra ferla, sameindavirkni og frumuhluta. (C) MS mældi MAPT stig í CSF sýni (vinstri) og fylgni þess við sýni ELISA tau stig (hægri). Pearson fylgnistuðullinn með viðkomandi P gildi birtist. Vegna skorts á ELISA gögnum fyrir eitt AD tilfelli innihalda þessar tölur gildi fyrir 38 af 39 greindum tilfellum. (D) Stýrð klasagreining (P <0,0001, Benjamini-Hochberg (BH) stillt P <0,01) á viðmiðunar- og AD CSF fundu sýni með því að nota 65 mest marktækt breytta prótein í gagnasettinu. Staðla, staðla.
Próteinmagn MAPT er nátengt sjálfstætt mældu ELISA tau stigi (r = 0,78, P = 7,8 × 10-9; mynd 1C), sem styður réttmæti MS mælingar okkar. Eftir meltingu trypsíns á stigi amyloid forverapróteins (APP), er ekki hægt að jóna ísóformssértæku peptíðin sem kortlögð eru á C-enda Aβ1-40 og Aβ1-42 á skilvirkan hátt (27, 28). Þess vegna hafa APP peptíðin sem við greindum ekkert með ELISA Aβ1-42 gildi að gera. Til þess að meta mismunatjáningu hvers tilviks, notuðum við mismunandi tjáð prótein með P <0,0001 [fals discovery rate (FDR) leiðrétt P <0,01] til að framkvæma eftirlitsþyrpingagreiningu á sýnunum (tafla S2A). Eins og sýnt er á mynd 1D geta þessi 65 mjög marktæku prótein flokkað sýni rétt í samræmi við sjúkdómsástand, nema eitt AD tilfelli með samanburðarlík einkenni. Af þessum 65 próteinum jukust 63 í AD en aðeins tveimur (CD74 og ISLR) lækkuðu. Alls hafa þessar heila- og mænuvökvagreiningar greint hundruð próteina í AD sem gætu þjónað sem lífmerki fyrir sjúkdóma.
Síðan gerðum við óháða netgreiningu á AD heilapróteininu. Heilahópur þessarar uppgötvunar innihélt dorsolateral prefrontal cortex (DLPFC) frá samanburðar (n = 10), Parkinsonsveiki (PD; n = 10), blönduð AD/PD (n = 10) og AD (n = 10) tilfelli. ) Sýnishorn. Emery Goizueta ADRC. Lýðfræði þessara 40 tilvika hefur áður verið lýst (25) og eru teknar saman í töflu S1B. Við notuðum TMT-MS til að greina þessa 40 heilavef og afritunarhóp 27 tilfella. Alls framleiddu þessi tvö heilagagnasett 227.121 einstök peptíð, sem voru kortlögð á 12.943 próteóm (25). Aðeins þau prótein sem voru magngreind í að minnsta kosti 50% tilvika voru tekin með í síðari rannsóknum. Lokauppgötvunargagnasettið inniheldur 8817 magngreind prótein. Stilltu magn próteina út frá aldri, kyni og eftir slátrun (PMI). Mismunatjáningargreining gagnasettsins eftir aðhvarf sýndi að >2000 próteinmagn var marktækt breytt [P <0,05, dreifigreining (ANOVA)] í tveimur eða fleiri sjúkdómshópum. Síðan gerðum við þyrpingagreiningu undir eftirliti sem byggist á próteinum sem tjáð eru með mismunandi hætti og P <0,0001 í AD/stjórn og/eða AD/PD samanburði (Mynd S2, A og B, Tafla S2C). Þessi 165 mjög breyttu prótein sýna skýrt tilfelli með AD meinafræði frá viðmiðunar- og PD sýnum, sem staðfestir sterkar AD-sértækar breytingar á öllu próteininu.
Við notuðum síðan reiknirit sem kallast Weighted Gene Co-expression Network Analysis (WGCNA) til að framkvæma netgreiningu á uppgötvuðu heilapróteininu, sem skipuleggur gagnasettið í próteineiningar með svipuðu tjáningarmynstri (11-13). Greiningin greindi 44 einingar (M) samtjáð prótein, flokkuð og númeruð frá því stærsta (M1, n = 1821 prótein) til þess minnsta (M44, n = 34 prótein) (Mynd 2A og Tafla S2D) ). Eins og getið er hér að ofan (13) Reiknaðu dæmigert tjáningarsnið eða einkennandi prótein hvers eininga og tengdu það við sjúkdómsástand og AD meinafræði, það er að koma á bandalagi Alzheimerssjúkdómaskrárinnar (CERAD) og Braak Score (Mynd 2B). Í heildina voru 17 einingar marktækt tengdar AD taugameinafræði (P <0,05). Margar af þessum sjúkdómstengdu einingum eru einnig ríkar af frumugerðarsértækum merkjum (Mynd 2B). Eins og getið er hér að ofan (13), er auðgun frumutegunda ákvörðuð með því að greina skörun eininga og tilvísunarlista yfir frumugerðarsértæk gen. Þessi gen eru unnin úr birtum gögnum í einangruðum mústaugafrumum, æðaþels- og glialfrumum. Tilraun RNA raðgreiningar (RNA-seq) (29).
(A) Uppgötvaðu WGCNA heilapróteinsins. (B) Biweight midcorrelation (BiCor) greining á eininga einkennispróteininu (fyrsti aðalþátturinn í mátpróteintjáningu) með AD taugameinafræðilegum einkennum (efst), þar á meðal CERAD (Aβ veggskjöldur) og Braak (tau tangles) stig. Styrkur jákvæðrar (rauðrar) og neikvæðrar (blár) fylgni er sýndur með tveggja lita hitakorti og stjörnur gefa til kynna tölfræðilega marktekt (P <0,05). Notaðu Hypergeometric Fisher's Exact Test (FET) (neðst) til að meta frumutegundartengsl hverrar próteineiningar. Styrkur rauða skyggingarinnar gefur til kynna hversu auðgun frumutegundar er og stjörnustjarnan gefur til kynna tölfræðilega marktekt (P <0,05). Notaðu BH aðferðina til að leiðrétta P gildið sem fæst úr FET. (C) GO greining á mátpróteinum. Næstskyldustu líffræðilegu ferlin eru sýnd fyrir hverja einingu eða tengdan einingahóp. fákeppni, oligodendrocyte.
Set af fimm nátengdum stjarnfrumu- og örveruríkum einingum (M30, M29, M18, M24 og M5) sýndu sterka jákvæða fylgni við AD taugameinafræði (Mynd 2B). Verufræðigreining tengir þessar glial einingar við frumuvöxt, fjölgun og ónæmi (Mynd 2C og Tafla S2E). Tvær glial einingar til viðbótar, M8 og M22, eru einnig mjög uppstýrðar í sjúkdómum. M8 er mjög skylt Toll-eins viðtakaferli, merkjafalli sem gegnir lykilhlutverki í meðfæddu ónæmissvörun (30). Á sama tíma er M22 nátengd breytingum eftir þýðingar. M2, sem er ríkt af oligodendrocytes, sýnir sterka jákvæða fylgni við AD meinafræði og verufræðileg tengsl við núkleósíð nýmyndun og DNA eftirmyndun, sem gefur til kynna aukna frumufjölgun í sjúkdómum. Á heildina litið styðja þessar niðurstöður hækkun glial-eininga sem við höfum áður séð í AD netpróteininu (13, 17). Eins og er kemur í ljós að margar AD-tengdar glial einingar á netinu sýna lægri tjáningarstig í stjórnunar- og PD tilfellum, sem undirstrikar sjúkdómssérhæfni þeirra sem er hækkuð í AD (Mynd S2C).
Aðeins fjórar einingar í netpróteininu okkar (M1, M3, M10 og M32) eru í sterkri neikvæðri fylgni við AD meinafræði (P <0,05) (Mynd 2, B og C). Bæði M1 og M3 eru rík af taugafrumum. M1 er mjög skylt synaptic merkjum, en M3 er nátengt starfsemi hvatbera. Engar vísbendingar eru um auðgun frumna fyrir M10 og M32. M32 endurspeglar tengsl milli M3 og frumuefnaskipta, en M10 er mjög tengt frumuvexti og starfsemi örpípla. Í samanburði við AD eru allar fjórar einingarnar auknar í stjórn og PD, sem gefur þeim sjúkdómssértækar AD breytingar (Mynd S2C). Á heildina litið styðja þessar niðurstöður minnkað magn taugafrumnaríkra eininga sem við höfum áður séð í AD (13, 17). Í stuttu máli, netgreiningin á heilapróteininu sem við uppgötvuðum framleiddi AD-sérstaklega breyttar einingar í samræmi við fyrri niðurstöður okkar.
AD einkennist af snemma einkennalausu stigi (AsymAD), þar sem einstaklingar sýna amyloid uppsöfnun án klínískrar vitrænnar hnignunar (5, 31). Þetta einkennalausa stig er mikilvægur gluggi fyrir snemma uppgötvun og íhlutun. Við höfum áður sýnt fram á sterka eininga varðveislu AsymAD og AD heilanetspróteóms í óháðum gagnasöfnum (13, 17). Til þess að tryggja að heilanetið sem við uppgötvuðum nú sé í samræmi við þessar fyrri niðurstöður, greindum við varðveislu 44 eininga í endurteknu gagnasettinu frá 27 DLPFC stofnunum. Þessar stofnanir innihalda eftirlit (n = 10), AsymAD (n = 8) og AD (n = 9) tilvik. Eftirlits- og AD sýni voru innifalin í greiningu á uppgötvunarheilahópnum okkar (tafla S1B), en AsymAD tilvik voru aðeins einstök í afritunarhópnum. Þessi AsymAD tilvik komu einnig frá Emory Goizueta ADRC heilabankanum. Þrátt fyrir að vitsmunir hafi verið eðlilegir við andlátið voru amyloidmagn óeðlilega há (meðaltal CERAD, 2,8 ± 0,5) (tafla S1B).
TMT-MS greining á þessum 27 heilavef leiddi til magngreiningar á 11.244 próteómum. Þessi lokatalning inniheldur aðeins þau prótein sem eru magngreind í að minnsta kosti 50% sýnanna. Þetta endurtekna gagnasett inniheldur 8638 (98,0%) af 8817 próteinum sem fundust í uppgötvunarheilagreiningu okkar og hefur næstum 3000 marktækt breytt prótein á milli viðmiðunar- og AD-árganga (P <0,05, eftir pöruð t-próf Tukey til dreifnigreiningar) ( Tafla S2F). Meðal þessara próteina sem tjáð var með mismunandi hætti sýndu 910 einnig verulegar stigsbreytingar milli AD og heilapróteómstýringartilvika (P <0,05, eftir ANOVA Tukey parað t-próf). Það er athyglisvert að þessi 910 merki eru mjög samkvæm í stefnu breytinga milli próteóma (r = 0,94, P <1,0 × 10-200) (Mynd S3A). Meðal aukinna próteina eru próteinin með samkvæmustu breytingar á milli gagnasetta aðallega meðlimir glial-ríku M5 og M18 eininganna (MDK, COL25A1, MAPT, NTN1, SMOC1 og GFAP). Meðal minnkuðu próteina voru þeir sem voru með stöðugustu breytingar nánast eingöngu meðlimir M1 einingarinnar (NPTX2, VGF og RPH3A) sem tengdust taugamótinu. Við sannreyndum frekar AD-tengdar breytingar á midkine (MDK), CD44, seyttu frizzled-tengt próteini 1 (SFRP1) og VGF með Western blotting (Mynd S3B). Eininga varðveislugreining sýndi að um 80% af próteineiningum (34/44) í heilapróteininu voru marktækt varðveitt í afritunargagnasettinu (z-stig> 1,96, FDR leiðrétt P <0,05) (Mynd S3C). Fjórtán af þessum einingum voru sérstaklega fráteknar á milli próteómanna tveggja (z-stig> 10, FDR leiðrétt P <1,0 × 10-23). Á heildina litið, uppgötvun og endurmyndun á mikilli samkvæmni í mismunatjáningu og mátsamsetningu milli heilapróteómsins undirstrikar endurgerðanleika breytinga á AD framhliðarberkispróteinum. Að auki staðfesti það einnig að AsymAD og lengra komna sjúkdómar hafa mjög svipaða heilanetkerfi.
Nánari greining á mismunatjáningu í afritunargagnasetti heila undirstrikar umtalsverða gráðu AsymAD próteinbreytinga, þar á meðal samtals 151 marktækt breytt prótein á milli AsymAD og eftirlitsins (P <0,05) (Mynd S3D). Í samræmi við amyloid álag jókst APP í heila AsymAD og AD verulega. MAPT breytist aðeins marktækt í AD, sem er í samræmi við aukið magn flækja og þekkta fylgni þess við vitræna hnignun (5, 7). Glial-ríku einingarnar (M5 og M18) endurspeglast mjög í auknum próteinum í AsymAD, en taugafrumnatengda M1 einingin er mest dæmigerð fyrir minnkuðu próteinin í AsymAD. Mörg þessara AsymAD merkja sýna meiri breytingar á einkennum sjúkdóma. Meðal þessara merkja er SMOC1, glial prótein sem tilheyrir M18, sem tengist heilaæxlum og þróun augna og útlima (32). MDK er heparínbindandi vaxtarþáttur sem tengist frumuvexti og æðamyndun (33), annar meðlimur M18. Í samanburði við samanburðarhópinn jókst AsymAD marktækt, fylgt eftir með meiri aukningu á AD. Aftur á móti var synaptic prótein neuropentraxin 2 (NPTX2) marktækt minnkað í AsymAD heilanum. NPTX2 var áður tengt taugahrörnun og hefur viðurkennt hlutverk í að miðla örvandi taugamótum (34). Á heildina litið sýna þessar niðurstöður ýmsar mismunandi forklínískar próteinbreytingar í AD sem virðast þróast með alvarleika sjúkdómsins.
Í ljósi þess að við höfum náð umtalsverðri dýpt próteinþekju við uppgötvun heilapróteómsins, erum við að reyna að skilja betur skörun þess við AD umritið á netstigi. Þess vegna bárum við saman heilapróteinið sem við uppgötvuðum við eininguna sem við bjuggum til úr örfylkismælingu á 18.204 genum í AD (n = 308) og stjórn (n = 157) DLPFC vefjum (13). skarast. Alls auðkenndum við 20 mismunandi RNA-einingar, sem margar hverjar sýndu auðgun á tilteknum frumugerðum, þar á meðal taugafrumum, oligodendrocytes, stjarnfrumur og microglia (mynd 3A). Margar breytingar á þessum einingum í AD eru sýndar á mynd 3B. Í samræmi við fyrri prótein-RNA skörunargreiningu okkar með því að nota dýpri ómerkta MS próteinið (um 3000 prótein) (13), eru flestar 44 einingar í heilapróteómnetinu sem við fundum í umskriftarnetinu. Það er engin marktæk skörun í. Jafnvel í Uppgötvun okkar og afritun á 34 próteineiningar sem eru mjög varðveittar í heilapróteóminu, aðeins 14 (~40%) stóðust Fishers nákvæma próf (FET) reyndust hafa tölfræðilega marktæka skörun við umritið (mynd 3A). Samhæft við viðgerð á DNA skemmdum (P-M25 og P-M19), próteinþýðingu (P-M7 og P-M20), RNA-bindingu/splæsingu (P-M16 og P-M21) og próteinmiðun (P-M13 og P- M23) skarast ekki við einingar í umritinu. Þess vegna, þó að dýpri próteingagnasett sé notað í núverandi skörunargreiningu (13), er flest AD netpróteinið ekki kortlagt á umritanetið.
(A) Hypergeometric FET sýnir auðgun frumugerðarsértækra merkja í RNA-einingu AD umrita (efst) og hversu skörunarstig er á milli RNA (x-ás) og prótein (y-ás) eininga AD heilans (neðst). Styrkur rauða skyggingarinnar gefur til kynna hversu auðgun frumutegunda er í efsta spjaldinu og styrk skörunar eininga á neðsta spjaldinu. Stjörnumerki gefa til kynna tölfræðilega marktekt (P <0,05). (B) Fylgni milli einkennandi gena hvers umritseiningar og AD stöðu. Einingarnar til vinstri eru neikvæðustu fylgnin við AD (bláar) og þær til hægri eru jákvæðustu fylgnin við AD (rautt). Log-umbreytt BH-leiðrétt P gildi gefur til kynna hversu tölfræðilega marktekt hverrar fylgni er. (C) Verulegar einingar sem skarast með sameiginlegri auðgun frumutegunda. (D) Fylgnigreining á log2-falt breytingu á merktu próteini (x-ás) og RNA (y-ás) í skarasteiningunni. Pearson fylgnistuðullinn með viðkomandi P gildi birtist. Micro, microglia; himintungla, stjarnfrumur. CT, stjórn.
Flestar prótein- og RNA-einingar, sem skarast, deila svipuðum auðgunarsniðum frumutegunda og samkvæmri stefnubreytingu AD (Mynd 3, B og C). Með öðrum orðum, taugamótatengda M1-eining heilapróteómsins (PM1) er kortlögð á þrjár taugafrumuríkar samhæfar RNA-einingar (R-M1, R-M9 og R-M16), sem eru í AD. Báðir sýndu lækkað stig. Á sama hátt skarast glial-ríku M5 og M18 próteineiningarnar við RNA-einingar sem eru ríkar af stjarnfrumum og örglíummerkjum (R-M3, R-M7 og R-M10) og taka mikinn þátt í aukningu sjúkdóma. Þessir sameiginlegu einingaeiginleikar milli gagnasettanna tveggja styðja enn frekar við auðgun frumutegunda og sjúkdómstengdar breytingar sem við höfum fylgst með í heilapróteininu. Hins vegar sáum við marga marktæka mun á RNA- og próteinmagni einstakra merkja í þessum sameiginlegu einingum. Fylgnigreining á mismunatjáningu próteomics og transcriptomics sameindanna innan þessara skarastra eininga (Mynd 3D) undirstrikar þetta ósamræmi. Til dæmis sýndu APP og nokkur önnur glial module prótein (NTN1, MDK, COL25A1, ICAM1 og SFRP1) marktæka aukningu á AD próteóminu, en það var nánast engin breyting á AD umritinu. Þessar próteinsértæku breytingar geta verið nátengdar amyloid plaques (23, 35), sem undirstrikar próteinið sem uppsprettu meinafræðilegra breytinga og þessar breytingar endurspeglast kannski ekki í umritinu.
Eftir óháð greiningu á heila- og CSF próteinunum sem við uppgötvuðum, gerðum við alhliða greiningu á gagnasettunum tveimur til að bera kennsl á AD CSF lífmerki sem tengjast meinalífeðlisfræði heilanetsins. Við verðum fyrst að skilgreina skörun próteómanna tveggja. Þrátt fyrir að það sé almennt viðurkennt að CSF endurspegli taugaefnafræðilegar breytingar í AD heilanum (4), er nákvæmlega skörun milli AD heilans og CSF próteinsins óljós. Með því að bera saman fjölda sameiginlegra genaafurða sem greindust í próteómunum okkar tveimur, komumst við að því að næstum 70% (n = 1936) próteina sem greindust í heila- og mænuvökvanum voru einnig magngreind í heilanum (Mynd 4A). Flest þessara próteina sem skarast (n = 1721) eru kortlögð á eina af 44 samtjáningareiningum úr uppgötvunarheilagagnasettinu (Mynd 4B). Eins og búist var við sýndu sex stærstu heilaeiningarnar (M1 til M6) mesta magn af CSF skörun. Hins vegar eru til smærri heilaeiningar (til dæmis M15 og M29) sem ná óvænt mikilli skörun, stærri en heilaeining sem er tvöföld. Þetta hvetur okkur til að taka upp ítarlegri, tölfræðilega knúna aðferð til að reikna út skörun milli heila og heila- og mænuvökva.
(A og B) Próteinin sem greindust í uppgötvunarheilanum og CSF gagnasettum skarast. Flest þessara próteina sem skarast eru tengd einni af 44 samtjáningareiningum heilasamtjáningarnetsins. (C) Uppgötvaðu skörun milli heila- og mænuvökvapróteinsins og heilanetspróteinsins. Hver röð á hitakortinu táknar sérstaka skörunargreiningu á hágeometric FET. Efsta röðin sýnir skörun (grá/svört skygging) milli heilaeiningarinnar og alls CSF próteinsins. Önnur línan sýnir að skörun á milli heilareininga og CSF prótein (skyggað í rauðu) er marktækt uppstýrt í AD (P <0,05). Þriðja röð sýnir að skörun milli heilaeiningar og CSF prótein (blá skygging) er marktækt niðurstýrð í AD (P <0,05). Notaðu BH aðferðina til að leiðrétta P gildið sem fæst úr FET. (D) Spjaldið sem fellur saman mát byggt á tengingu frumutegunda og tengdum GO skilmálum. Þessi spjöld innihalda samtals 271 heilatengd prótein, sem hafa þýðingarmikla mismunatjáningu í CSF próteininu.
Með því að nota einhliða FET, metum við mikilvægi próteinskörunar milli CSF próteinsins og einstakra heilaeininga. Greiningin leiddi í ljós að alls 14 heilaeiningar í CSF gagnasettinu hafa tölfræðilega marktæka skörun (FDR leiðrétt P <0,05) og viðbótareining (M18) þar sem skörun er nálægt marktekt (FDR leiðrétt P = 0,06) (Mynd 4C) , efstu röð). Við höfum líka áhuga á einingum sem skarast mjög við CSF prótein sem eru tjáð með mismunandi hætti. Þess vegna beittum við tveimur FET greiningum til viðbótar til að ákvarða hvaða af (i) CSF próteini var marktækt aukið í AD og (ii) CSF prótein var marktækt lækkað í AD (P <0,05, parað t próf AD/viðmiðun) Heilaeiningar með marktækri skörun á milli þeirra. Eins og sýnt er í mið- og neðstu röðum á mynd 4C sýna þessar viðbótargreiningar að 8 af 44 heilaeiningum skarast verulega við próteinið sem bætt er við AD CSF (M12, M1, M2, M18, M5, M44, M33 og M38) . ), á meðan aðeins tvær einingar (M6 og M15) sýndu þýðingarmikla skörun við minnkað prótein í AD CSF. Eins og búist var við eru allar 10 einingarnar í þeim 15 einingar sem hafa mesta skörun við CSF próteinið. Þess vegna gerum við ráð fyrir að þessar 15 einingar séu hágæða uppsprettur af AD heilaafleiddum CSF lífmerkjum.
Við brautum saman þessar 15 einingar sem skarast í fimm stór próteinspjöld byggð á nálægð þeirra í WGCNA tré skýringarmyndinni og tengslum þeirra við frumugerðir og genaverufræði (Mynd 4D). Fyrsta spjaldið inniheldur einingar sem eru ríkar af taugafrumum og taugamótatengdum próteinum (M1 og M12). Synaptic spjaldið inniheldur alls 94 prótein og magnið í CSF próteininu hefur breyst verulega, sem gerir það að stærstu uppsprettu heilatengdra CSF merkja meðal fimm spjaldanna. Annar hópurinn (M6 og M15) sýndi fram á náin tengsl við æðaþelsfrumumerki og æðalíkamann, svo sem „sárgræðslu“ (M6) og „stjórnun á húmoral ónæmissvörun“ (M15). M15 er einnig mjög skylt efnaskiptum lípópróteina, sem er nátengt æðaþeli (36). Æðaspjaldið inniheldur 34 CSF merki sem tengjast heilanum. Þriðji hópurinn inniheldur einingar (M2 og M4) sem eru marktækt tengdar fákeppnismerkjum og frumufjölgun. Til dæmis innihalda efstu verufræðiskilmálar M2 „jákvæða stjórnun á DNA eftirmyndun“ og „púrínlífmyndunarferli“. Á sama tíma innihalda þær af M4 „aðgreiningu gliumfrumna“ og „aðskilnað litninga“. Mylinhreinsunarspjaldið inniheldur 49 CSF merki sem tengjast heilanum.
Fjórði hópurinn inniheldur flestar einingar (M30, M29, M18, M24 og M5), og næstum allar einingarnar eru verulega ríkar af míkróglíum og stjarnfrumumerkjum. Svipað og mergmiðlunarspjaldið inniheldur fjórða spjaldið einnig einingar (M30, M29 og M18) sem eru nátengdar frumufjölgun. Hinar einingarnar í þessum hópi eru mjög tengdar ónæmisfræðilegum hugtökum, svo sem „ónæmisáhrifaferli“ (M5) og „ónæmissvörunarstjórnun“ (M24). Glial ónæmishópurinn inniheldur 42 CSF merki sem tengjast heilanum. Að lokum inniheldur síðasta spjaldið 52 heilatengd merki á einingunum fjórum (M44, M3, M33 og M38), sem öll eru á líkamanum sem tengjast orkugeymslu og efnaskiptum. Stærsta þessara eininga (M3) er náskyld hvatberum og er rík af taugasértækum merkjum. M38 er einn af smærri einingunum í þessu umbrotsefni og sýnir einnig miðlungsmikla sérhæfingu taugafrumna.
Á heildina litið endurspegla þessar fimm spjöld fjölbreytt úrval frumutegunda og virkni í AD heilaberki og innihalda sameiginlega 271 heilatengd CSF merki (tafla S2G). Til þess að meta réttmæti þessara MS-niðurstaðna notuðum við nálægðarframlengingarprófið (PEA), hornrétta mótefnatækni með margföldunargetu, mikla næmni og sérhæfni, og endurgreindum heila- og mænuvökvasýnin sem við fundum. Hlutmengi þessara 271 lífmerkja (n = 36). Þessi 36 markmið sýna breytingu á AD margfeldi PEA, sem er nátengd MS-undirstaða niðurstöðum okkar (r = 0,87, P = 5,6 × 10-12), sem staðfesti mjög niðurstöður alhliða MS greiningar okkar (Mynd S4) ).
Líffræðilegu þemu sem fimm hóparnir okkar leggja áherslu á, allt frá taugamótaboðum til orkuefnaskipta, eru öll tengd meingerð AD (1-3). Þess vegna eru allar 15 einingarnar sem innihalda þessar spjöld tengdar AD meinafræði í heilapróteininu sem við uppgötvuðum (Mynd 2B). Mest áberandi er mikil jákvæð sjúkleg fylgni milli glial eininga okkar og sterk neikvæð sjúkleg fylgni milli stærstu taugafrumna okkar (M1 og M3). Mismunatjáningargreiningin á endurteknu heilapróteóminu okkar (Mynd S3D) undirstrikar einnig M5 og M18 glial prótein. Í AsymAD og einkennum AD, mest aukning glial prótein og M1 tengd taugamót Próteinið minnkar mest. Þessar athuganir benda til þess að 271 heila- og mænuvökvamerkin sem við greindum í hópunum fimm tengist sjúkdómsferlum í AD heilaberki, þar með talið þeim sem eiga sér stað á fyrstu einkennalausu stigunum.
Til þess að greina betur stefnubreytingu spjaldapróteina í heila og mænuvökva, teiknuðum við eftirfarandi fyrir hverja af 15 einingunum sem skarast: (i) fundum mælieininguna í heilagagnasettinu og (ii) einingunni prótein Mismunurinn kemur fram í heila- og mænuvökvanum (Mynd S5). Eins og áður hefur komið fram er WGCNA notað til að ákvarða magn einingar eða einkennandi próteingildi í heilanum (13). Eldfjallakortið er notað til að lýsa mismunatjáningu einingapróteina í heila- og mænuvökva (AD/stjórn). Þessar tölur sýna að þrjú af fimm spjöldum sýna mismunandi tjáningarþróun í heila og mænuvökva. Tvær einingar taugamótaspjaldsins (M1 og M12) sýna lækkun á magni í AD heilanum, en skarast verulega við aukið prótein í AD CSF (Mynd S5A). Taugatengdu einingarnar sem innihalda umbrotið (M3 og M38) sýndu svipað tjáningarmynstur heila og heila- og mænuvökva ósamræmi (Mynd S5E). Æðaspjaldið sýndi einnig mismunandi tjáningarþróun, þó að einingar þess (M6 og M15) hafi verið í meðallagi aukin í AD heilanum og minnkuð í sýktum CSF (Mynd S5B). Hinar tvær spjöldin sem eftir eru innihalda stór glial net þar sem próteinin eru stöðugt uppstillt í báðum hólfum (Mynd S5, C og D).
Vinsamlegast athugið að þessi þróun er ekki algeng fyrir alla merkja á þessum spjöldum. Til dæmis inniheldur synaptic spjaldið nokkur prótein sem eru verulega skert í AD heila og CSF (Mynd S5A). Meðal þessara niðurstýrðu heila- og mænuvökvamerkja eru NPTX2 og VGF af M1 og chromogranin B af M12. Hins vegar, þrátt fyrir þessar undantekningar, eru flest taugamótamerki okkar hækkuð í AD mænuvökva. Á heildina litið gátu þessar greiningar greint tölfræðilega marktæka þróun í þéttni heila og mænuvökva í hverju af fimm spjaldunum okkar. Þessi þróun varpar ljósi á flókið og oft ólíkt samband milli heila og CSF prótein tjáningar í AD.
Síðan notuðum við MS afritunargreiningu með mikilli afköstum (CSF afritun 1) til að þrengja 271 sett af lífmerkjum við efnilegustu og endurskapanlegustu markmiðin (Mynd 5A). CSF eintak 1 inniheldur alls 96 sýni frá Emory Goizueta ADRC, þar á meðal samanburðar-, AsymAD- og AD-hóp (tafla S1A). Þessi AD tilfelli einkennast af vægri vitrænni hnignun (meðal MoCA, 20,0 ± 3,8) og breytingum á AD lífmerkjum staðfest í heila- og mænuvökva (tafla S1A). Öfugt við CSF greininguna sem við fundum, er þessi afritun framkvæmd með skilvirkari og afkastamikilli „einstöku“ MS-aðferð (án sundurhlutunar án nettengingar), þar á meðal einfaldaðri sýnishornsaðferð sem útilokar þörfina á ónæmisskemmdum einstakra sýna. . Þess í stað er ein ónæmissnautt „aukningsrás“ notuð til að magna merki um minna magn próteina (37). Þrátt fyrir að hún dragi úr heildarþekju próteómsins dregur þessi staka skotaðferð verulega úr vélartíma og eykur fjölda TMT-merktra sýna sem hægt er að greina raunhæfar (17, 38). Alls greindist greiningin á 6.487 peptíð, sem voru kortlögð í 1.183 próteóm í 96 tilfellum. Eins og með CSF greininguna sem við fundum voru aðeins þau prótein sem voru magngreind í að minnsta kosti 50% sýnanna tekin með í síðari útreikningum og gögnin voru afturkölluð fyrir áhrif aldurs og kyns. Þetta leiddi til endanlegrar magngreiningar á 792 próteómum, 95% þeirra voru einnig auðkennd í CSF gagnasettinu sem fannst.
(A) Heilatengd CSF próteinmarkmið staðfest í fyrsta endurtekna CSF hópnum og tekin með í lokaspjaldið (n = 60). (B til E) Lífmerkisstig (samsett z-stig) mælt í fjórum CSF-afritunarhópunum. Pöruð t-próf eða ANOVA með Tukey's eftirleiðréttingu voru notuð til að meta tölfræðilega mikilvægi breytinga á magni í hverri endurtekinni greiningu. CT, stjórn.
Þar sem við höfum sérstakan áhuga á að sannreyna 271 heilatengd CSF markmið okkar með alhliða greiningu, munum við takmarka frekari skoðun á þessu endurtekna próteómi við þessi merki. Meðal þessara 271 próteina greindust 100 í CSF afritun 1. Mynd S6A sýnir mismunatjáningu þessara 100 skarastmerkja milli viðmiðunar- og AD afritunarsýna. Synaptic histón og umbrotsefni eykst mest í AD, en æðaprótein lækka mest í sjúkdómum. Flest 100 merkjanna sem skarast (n = 70) héldu sömu breytingastefnu í gagnasöfnunum tveimur (Mynd S6B). Þessir 70 fullgiltu heilatengdu CSF merki (tafla S2H) endurspegla að mestu leyti þá þróun sem áður hefur sést á spjaldatjáningu, það er að segja niður-stjórnun æðapróteina og upp-stjórnun allra annarra spjalda. Aðeins 10 af þessum 70 fullgiltu próteinum sýndu breytingar á AD gnægð sem stangaðist á við þessa þróun. Til þess að búa til spjaldið sem best endurspeglar heildarþróun heilans og heila- og mænuvökvans, útilokuðum við þessi 10 prótein frá áhugasviðinu sem við staðfestum að lokum (Mynd 5A). Þess vegna inniheldur pallborðið okkar á endanum samtals 60 prótein staðfest í tveimur óháðum CSF AD hópum með mismunandi sýnis undirbúningi og MS vettvangsgreiningu. Z-stig tjáningarreitirnir á þessum lokaspjöldum í CSF afriti 1 eftirlitinu og AD tilfellum staðfestu spjaldsþróunina sem sést í CSF hópnum sem við fundum (Mynd 5B).
Meðal þessara 60 próteina eru sameindir sem vitað er að tengjast AD, eins og osteopontin (SPP1), sem er bólgueyðandi frumudrep sem hefur verið tengt við AD í mörgum rannsóknum (39-41), og GAP43, Synaptic prótein. sem er greinilega tengt taugahrörnun (42). Fullreynustu próteinin eru merki sem tengjast öðrum taugahrörnunarsjúkdómum, svo sem amyotrophic lateral sclerosis (ALS) tengdum ofuroxíð dismutasi 1 (SOD1) og Parkinsons-sjúkdóms tengdum desaccharase (PARK7). Við höfum einnig sannreynt að mörg önnur merki, eins og SMOC1 og heilaríkt himnuviðhengi merkjaprótein 1 (BASP1), hafa takmarkað fyrri tengsl við taugahrörnun. Þess má geta að vegna lítillar heildarmagns þeirra í CSF próteininu er erfitt fyrir okkur að nota þessa afkastamiklu einstöku greiningaraðferð til að greina MAPT og ákveðin önnur AD-tengd prótein (til dæmis NEFL og NRGN) ) (43, 44).
Við skoðuðum síðan þessi 60 forgangsmerki í þremur viðbótargreiningum. Í CSF Copy 2 notuðum við eitt TMT-MS til að greina óháðan hóp 297 viðmiðunar- og AD sýnum frá Emory Goizueta ADRC (17). CSF afritun 3 innihélt endurgreiningu á tiltækum TMT-MS gögnum frá 120 viðmiðunar- og AD sjúklingum frá Lausanne, Sviss (45). Við fundum meira en tvo þriðju af 60 forgangsmerkjum í hverju gagnasafni. Þrátt fyrir að svissneska rannsóknin hafi notað mismunandi MS vettvang og TMT magngreiningaraðferðir (45, 46), endurgerðum við spjaldstefnur okkar sterklega í tveimur endurteknum greiningum (Mynd 5, C og D, og töflur S2, I og J). Til að meta sjúkdómssérhæfni hópsins okkar notuðum við TMT-MS til að greina fjórða afritunargagnasettið (CSF afritun 4), sem innihélt ekki aðeins eftirlit (n = 18) og AD (n = 17) tilfelli, heldur einnig PD ( n = 14)), ALS (n = 18) og frontotemporal dementia (FTD) sýni (n = 11) (tafla S1A). Við töluðum með góðum árangri næstum tveir þriðju hlutar spjaldapróteina í þessum hópi (38 af 60). Þessar niðurstöður undirstrika AD-sértækar breytingar á öllum fimm lífmerkjaspjöldum (Mynd 5E og Tafla S2K). Aukningin í umbrotsefnishópnum sýndi sterkustu AD-sérhæfni, þar á eftir kom mergæða- og glialhópur. Í minna mæli sýnir FTD einnig aukningu á milli þessara spjalda, sem gæti endurspeglað svipaðar hugsanlegar netbreytingar (17). Aftur á móti sýndu ALS og PD næstum sömu mergmyndun, glial og efnaskiptasnið og viðmiðunarhópurinn. Á heildina litið, þrátt fyrir mismun á undirbúningi sýna, MS vettvang og TMT magngreiningaraðferðum, sýna þessar endurteknu greiningar að forgangsmerki okkar hafa mjög samkvæmar AD-sértækar breytingar í meira en 500 einstökum CSF sýnum.
AD taugahrörnun hefur verið almennt viðurkennd nokkrum árum áður en vitsmunaleg einkenni komu fram og því er brýn þörf á lífmerkjum AsymAD (5, 31). Hins vegar sýna fleiri og fleiri vísbendingar að líffræði AsymAD er langt frá því að vera einsleit og flókið samspil áhættu og seiglu leiðir til mikils einstaklingsmunar í síðari sjúkdómsframvindu (47). Þrátt fyrir að það sé notað til að bera kennsl á AsymAD tilfelli, hefur gildi kjarna CSF lífmerkja (Aβ1-42, heildar tau og p-tau) ekki reynst geta sagt áreiðanlega fyrir um hver muni þróast í heilabilun (4, 7), sem gefur til kynna meira. nauðsynlegt að fela í sér heildræn lífmerkisverkfæri sem byggja á mörgum þáttum lífeðlisfræði heilans til að laga áhættu þessa íbúa nákvæmlega. Þess vegna greindum við síðan AD-fullgilt lífmerkjahópinn okkar í AsymAD þýðinu af CSF afriti 1. Þessi 31 AsymAD tilvik sýndu óeðlileg kjarna lífmerkjagildi (Aβ1–42/heildar tau ELISA hlutfall, <5,5) og fullkomna vitsmuni (meðal MoCA, 27,1) ± 2,2) (tafla S1A). Að auki hafa allir einstaklingar með AsymAD klínískt heilabilunarstig upp á 0, sem gefur til kynna að engar vísbendingar séu um minnkun á daglegum vitrænum eða starfrænum frammistöðu.
Við greindum fyrst magn fullgiltu spjaldanna í öllum 96 CSF endurtekningunum 1, þar á meðal AsymAD hópnum. Við komumst að því að nokkur spjöld í AsymAD hópnum höfðu verulegar AD-líkar gnægðsbreytingar, æðaspjaldið sýndi lækkun á AsymAD, á meðan öll önnur spjöld sýndu upp á við (Mynd 6A). Þess vegna sýndu öll spjaldið mjög marktæka fylgni við ELISA Aβ1-42 og heildarmagn tau (Mynd 6B). Aftur á móti er fylgnin milli hópsins og MoCA-stigsins tiltölulega léleg. Ein af áberandi niðurstöðum þessara greininga er hið mikla úrval af spjaldtölvum í AsymAD hópnum. Eins og sýnt er á mynd 6A fer spjaldið í AsymAD hópnum venjulega yfir spjaldið í samanburðarhópnum og AD hópnum, sem sýnir tiltölulega mikinn breytileika. Til að kanna frekar þessa misleitni AsymAD, notuðum við Multidimensional Scaling (MDS) greiningu á 96 CSF afritunar 1 tilvik. MDS greining gerir kleift að sjá líkindi milli tilvika út frá ákveðnum breytum í gagnasafninu. Fyrir þessa klasagreiningu notum við aðeins þá fullgiltu pallborðsmerki sem hafa tölfræðilega marktæka breytingu (P <0,05, AD/viðmiðun) á CSF uppgötvun og afritun 1 prótein (n = 29) (tafla S2L). Þessi greining leiddi til skýrrar staðbundinnar þyrpingar milli stjórnunar okkar og AD tilvika (Mynd 6C). Aftur á móti eru sum AsymAD tilfelli greinilega flokkuð í samanburðarhópnum, á meðan önnur eru staðsett í AD tilfellum. Til að kanna frekar þessa AsymAD misleitni, notuðum við MDS kortið okkar til að skilgreina tvo hópa af þessum AsymAD tilfellum. Fyrsti hópurinn innihélt AsymAD tilfelli sem voru þyrpt nær viðmiðunarhópnum (n = 19), á meðan seinni hópurinn einkenndist af AsymAD tilfellum með merkjasnið nær AD (n = 12).
(A) Tjáningarstig (z-stig) CSF lífmerkjahópsins í öllum 96 sýnum í CSF afritunar 1 hópnum, þar á meðal AsymAD. Dreifnigreining með Tukey's eftirleiðréttingu var notuð til að meta tölfræðilega mikilvægi breytinga á gnægð pallborðs. (B) Fylgnigreining á magni próteina í pallborði (z-stig) við MoCA stig og heildar tau stig í ELISA Aβ1-42 og CSF afrit 1 sýni. Pearson fylgnistuðullinn með viðkomandi P gildi birtist. (C) MDS í 96 tilfellum af CSF afriti 1 var byggt á magni 29 fullgiltra pallborðsmerkja, sem voru verulega breytt bæði í uppgötvun og CSF afrit 1 gagnasettum [P <0,05 AD/eftirlit (CT)]. Þessi greining var notuð til að skipta AsymAD hópnum í samanburðarhópa (n = 19) og AD (n = 12) undirhópa. (D) Eldfjallalóðin sýnir mismunatjáningu allra CSF afritunar 1 próteina með log2 falt breytingu (x-ás) miðað við -log10 tölfræðilega P gildi milli AsymAD undirhópanna tveggja. Lífmerkin á spjaldinu eru lituð. (E) CSF afritunar 1 gnægðsstig lífmerkja valhóps er mismunandi tjáð á milli AsymAD undirhópa. Eftirleiðrétt dreifnigreining Tukey var notuð til að meta tölfræðilega marktekt.
Við skoðuðum mismunandi próteintjáningu milli þessara stjórnunar og AD-líka AsymAD tilvika (Mynd 6D og Tafla S2L). Eldfjallakortið sem myndast sýnir að 14 spjaldmerki hafa breyst verulega á milli hópanna tveggja. Flest þessara merkja eru meðlimir taugamótsins og efnaskipta. Hins vegar tilheyra SOD1 og myristóýleruðu alanínríku próteinkínasa C hvarfefni (MARCKS), sem eru meðlimir mýelín- og glial ónæmishópanna, einnig þessum hópi (mynd 6, D og E). Æðaspjaldið lagði einnig til tvö merki sem voru verulega lækkuð í AD-líka AsymAD hópnum, þar á meðal AE bindandi prótein 1 (AEBP1) og viðbót fjölskyldumeðlimur C9. Enginn marktækur munur var á samanburðarhópum og AD-líkum AsymAD undirhópum í ELISA AB1-42 (P = 0,38) og p-tau (P = 0,28), en það var vissulega marktækur munur á heildar tau stigi (P = 0,0031) ) (Mynd S7). Það eru nokkrir spjaldmerki sem gefa til kynna að breytingarnar á milli AsymAD undirhópanna tveggja séu marktækari en heildarmagn tau (til dæmis YWHAZ, SOD1 og MDH1) (Mynd 6E). Á heildina litið benda þessar niðurstöður til þess að fullgilt spjaldið okkar gæti innihaldið lífmerki sem geta undirflokkað og hugsanlega áhættuflokkun sjúklinga með einkennalausan sjúkdóm.
Brýn þörf er á kerfistengdum lífmerkjaverkfærum til að mæla og miða betur við hinar ýmsu meinalífeðlisfræði sem liggja að baki AD. Búist er við að þessi verkfæri breyti ekki aðeins sjúkdómsgreiningarramma okkar, heldur stuðli það einnig að því að nota árangursríkar, sjúklingasértækar meðferðaraðferðir (1, 2). Í þessu skyni beittum við óhlutdrægri alhliða próteomics nálgun á AD heila og CSF til að bera kennsl á vefbundin CSF lífmerki sem endurspegla breitt svið af heilabundinni meinalífeðlisfræði. Greining okkar framleiddi fimm CSF lífmerkispjöld, sem (i) endurspegla taugamót, æðar, mýelín, ónæmis- og efnaskiptavanda; (ii) sýna fram á sterkan endurgerðanleika á mismunandi MS kerfum; (iii) Sýna framsæknar sjúkdómssértækar breytingar á fyrstu og seinustu stigum AD. Á heildina litið eru þessar niðurstöður lofandi skref í átt að þróun fjölbreyttra, áreiðanlegra, vefmiðaðra lífmerkjaverkfæra fyrir AD rannsóknir og klínískar umsóknir.
Niðurstöður okkar sýna fram á mjög varðveitt skipulag AD heilanetspróteinsins og styðja notkun þess sem akkeri fyrir kerfisbundna þróun lífmerkja. Greining okkar sýnir að tvö sjálfstæð TMT-MS gagnasöfn sem innihalda AD og AsymAD heila hafa sterka mát. Þessar niðurstöður framlengja fyrri vinnu okkar og sýna fram á varðveislu öflugra eininga meira en 2.000 heilavefja úr mörgum sjálfstæðum hópum í fram-, hliðar- og tímaberki (17). Þetta samstöðunet endurspeglar ýmsar sjúkdómstengdar breytingar sem fram hafa komið í núverandi rannsóknum, þar á meðal aukningu á glialríkum bólgueiningum og fækkun taugafrumnaríkra eininga. Eins og núverandi rannsóknir, hefur þetta stóra netkerfi einnig verulegar mátbreytingar á AsymAD, sem sýnir margvíslega mismunandi forklíníska meinafræði (17).
Hins vegar, innan þessa mjög íhaldssama kerfisbundna ramma, er meira fínkornað líffræðilegt ólíkt, sérstaklega meðal einstaklinga á fyrstu stigum AD. Lífmerkispjaldið okkar er fær um að sýna tvo undirhópa í AsymAD, sem sýna fram á verulega mismunatjáningu margra CSF merkja. Hópurinn okkar gat bent á líffræðilegan mun á þessum tveimur undirhópum, sem var ekki augljós á stigi kjarna AD lífmerkja. Í samanburði við samanburðarhópinn voru Aβ1-42/heildar tau hlutföll þessara AsymAD einstaklinga óeðlilega lág. Hins vegar voru aðeins heildar tau stigin marktækt mismunandi milli AsymAD undirhópanna tveggja, en Aβ1-42 og p-tau stigin héldust tiltölulega sambærileg. Þar sem há CSF tau virðist vera betri spá fyrir vitsmunaleg einkenni en Aβ1-42 stig (7), grunar okkur að AsymAD hóparnir tveir geti haft mismunandi áhættu á framgangi sjúkdóms. Í ljósi takmarkaðrar úrtaksstærðar AsymAD okkar og skorts á lengdargögnum er þörf á frekari rannsóknum til að draga þessar ályktanir af öryggi. Hins vegar benda þessar niðurstöður til þess að kerfisbundið CSF pallborð geti aukið getu okkar til að laga einstaklinga á áhrifaríkan hátt á einkennalausu stigi sjúkdómsins.
Á heildina litið styðja niðurstöður okkar hlutverk margra líffræðilegra aðgerða í meingerð AD. Hins vegar, óregluleg orkuefnaskipti urðu áberandi þema allra fimm fullgiltu merkingaspjaldanna okkar. Efnaskiptaprótein, eins og hypoxanthin-guanine fosfóríbósýltransferasa 1 (HPRT1) og laktat dehýdrógenasa A (LDHA), eru sterkustu staðfestu synaptic lífmerkin, sem gefa til kynna að aukningin á AD CSF sé mjög fjölhæfanlegt kynlíf. Æðar okkar og glial spjöld innihalda einnig nokkur merki sem taka þátt í umbrotum oxandi efna. Þessar niðurstöður eru í samræmi við lykilhlutverkið sem efnaskiptaferlar gegna í heilanum, ekki aðeins til að mæta mikilli orkuþörf taugafrumna, heldur einnig til að mæta mikilli orkuþörf stjarnfrumna og annarra glial frumna (17, 48). Niðurstöður okkar styðja vaxandi vísbendingar um að breytingar á enduroxunargetu og truflun á orkuferlum geti verið kjarnatengiliður milli nokkurra lykilferla sem taka þátt í meingerð AD, þar á meðal hvatberasjúkdóma, glial-miðlaða bólgu og æðaskemmdum (49). Að auki innihalda efnaskiptavísar heila- og mænuvökva mikinn fjölda mismunandi ríkra próteina milli stjórnunar okkar og AD-líka AsymAD undirhópa, sem bendir til þess að truflun á þessum orku- og afoxunarferlum gæti verið mikilvæg á forklínísku stigi sjúkdómsins.
Mismunandi þróun heila og heila- og mænuvökva sem við höfum fylgst með hafa einnig áhugaverðar líffræðilegar afleiðingar. Synapses og umbrotsefni rík af taugafrumum sýna minnkað magn í AD heilanum og aukið magn í heila- og mænuvökva. Í ljósi þess að taugafrumur eru ríkar af orkuframleiðandi hvatberum við taugamót til að veita orku fyrir fjölmörg sérhæfð merki þeirra (50), er búist við líkt tjáningarsniði þessara tveggja taugafrumnahópa. Tap á taugafrumum og útpressun skemmdra frumna getur útskýrt þessa þróun heila og CSF spjaldið í síðari sjúkdómum, en þeir geta ekki útskýrt fyrstu spjaldbreytingarnar sem við sjáum (13). Ein möguleg skýring á þessum niðurstöðum í byrjun einkennalausra sjúkdóma er óeðlileg taugamótaklipping. Nýjar vísbendingar í múslíkönum benda til þess að míkróglia-miðluð synaptic phagocytosis geti verið óeðlilega virkjuð í AD og leitt til snemma taugamótataps í heilanum (51). Þetta fleygða taugamótaefni getur safnast fyrir í CSF, þess vegna fylgjumst við með aukningu á CSF í taugafrumum. Ónæmismiðluð synaptic pruning getur einnig að hluta útskýrt aukningu á glial próteinum sem við sjáum í heila og heila- og mænuvökva í gegnum sjúkdómsferlið. Auk synaptic pruning, heildarfrávik í exocytic ferli geta einnig leitt til mismunandi heila og CSF tjáningu taugafrumum merkjum. Fjöldi rannsókna hefur sýnt að innihald exósóma í meingerð AD heila hefur breyst (52). Utanfrumuleiðin tekur einnig þátt í útbreiðslu Aβ (53, 54). Það er athyglisvert að bæling á utanaðkomandi seytingu getur dregið úr AD-líkri meinafræði í AD erfðabreyttum músalíkönum (55).
Á sama tíma sýndi próteinið í æðum spjaldið miðlungs aukningu í AD heilanum en minnkaði marktækt í CSF. Truflun á blóð-heilaþröskuldi (BBB) getur skýrt þessar niðurstöður að hluta. Margar óháðar rannsóknir á mönnum eftir slátrun hafa sýnt fram á niðurbrot BBB í AD (56, 57). Þessar rannsóknir staðfestu ýmsa óeðlilega starfsemi í kringum þetta þétt lokaða lag af æðaþelsfrumum, þar á meðal háræðaleka í heila og uppsöfnun blóðborinna próteina (57). Þetta getur gefið einfalda skýringu á hækkuðum æðapróteinum í heilanum, en það getur ekki útskýrt að fullu eyðingu þessara sömu próteina í heila- og mænuvökvanum. Einn möguleiki er að miðtaugakerfið sé virkan að einangra þessar sameindir til að leysa vandamálið með aukinni bólgu og oxunarálagi. Fækkunin á sumum af alvarlegustu CSF próteinum á þessu sviði, sérstaklega þeim sem taka þátt í stjórnun lípópróteina, tengist hömlun á skaðlegu magni bólgu og taugaverndarferli hvarfgjarnra súrefnistegunda. Þetta á við um Paroxonase 1 (PON1), lípóprótein bindandi ensím sem ber ábyrgð á að draga úr oxunarálagi í blóðrásinni (58, 59). Alfa-1-míkróglóbúlín/bikúnín forveri (AMBP) er annað marktækt niðurstýrt merki æðahópsins. Það er undanfari lípíðflutningsefnisins bikunin, sem einnig tekur þátt í bólgubælingu og taugavernd (60, 61).
Þrátt fyrir ýmsar áhugaverðar tilgátur er vanhæfni til að greina beint lífefnafræðilega sjúkdómsferli vel þekkt takmörkun á uppgötvunardrifinni próteomics greiningu. Þess vegna eru frekari rannsóknir nauðsynlegar til að skilgreina með öryggi aðferðirnar á bak við þessi lífmerkispjöld. Til þess að stefna að þróun MS-undirstaða klínískrar greiningar, krefst framtíðarstefnan einnig notkunar markvissra megindlegra aðferða við stórfellda sannprófun á lífmerkjum, svo sem sértækt eða samhliða eftirlit með viðbrögðum (62). Við notuðum nýlega samhliða viðbragðseftirlit (63) til að sannreyna margar af CSF próteinbreytingunum sem lýst er hér. Nokkur forgangsmarkmið eru magngreind með verulegri nákvæmni, þar á meðal YWHAZ, ALDOA og SMOC1, sem kortleggja sig á taugamót, efnaskipti og bólguspjöld okkar, í sömu röð (63). Óháð gagnaöflun (DIA) og aðrar aðferðir sem byggjast á MS geta einnig verið gagnlegar til að sannreyna mark. Bud o.fl. (64) Nýlega var sýnt fram á að það er veruleg skörun á milli AD lífmerkja sem auðkennd eru í CSF uppgötvunargagnasafninu okkar og óháða DIA-MS gagnasettsins, sem samanstendur af næstum 200 CSF sýnum frá þremur mismunandi evrópskum árgöngum. Þessar nýlegu rannsóknir styðja möguleika spjaldanna okkar til að breytast í áreiðanlega MS-undirstaða uppgötvun. Hefðbundin mótefna- og aptamer-undirstaða uppgötvun er einnig mikilvæg fyrir frekari þróun helstu AD lífmerkja. Vegna lítillar gnægð CSF er erfiðara að greina þessi lífmerki með MS-aðferðum með miklum afköstum. NEFL og NRGN eru tvö slík dæmi um lítið magn CSF lífmerkja, sem eru kortlögð á spjaldið í alhliða greiningu okkar, en ekki er hægt að greina áreiðanlega með því að nota eina MS stefnu okkar. Miðunaraðferðir byggðar á mörgum mótefnum, svo sem PEA, geta stuðlað að klínískri umbreytingu þessara merkja.
Á heildina litið veitir þessi rannsókn einstaka proteomics nálgun fyrir auðkenningu og sannprófun á CSF AD lífmerkjum sem byggjast á mismunandi kerfum. Hagræðing á þessum merkjaspjöldum yfir fleiri AD hópa og MS palla gæti reynst vænleg til að efla AD áhættu lagskiptingu og meðferð. Rannsóknir sem meta lengdarstig þessara spjalda með tímanum eru einnig mikilvægar til að ákvarða hvaða samsetning merkja lagskiptir best hættuna á snemma sjúkdómi og breytingum á alvarleika sjúkdómsins.
Fyrir utan 3 sýnin sem CSF afritaði, var öllum CSF sýnum sem notuð voru í þessari rannsókn safnað á vegum Emory ADRC eða náskyldra rannsóknastofnana. Alls voru fjögur sett af Emory CSF sýnum notuð í þessum próteinfræðirannsóknum. CSF hópurinn reyndist innihalda sýni frá 20 heilbrigðum viðmiðunarhópum og 20 AD sjúklingum. CSF eintak 1 inniheldur sýni frá 32 heilbrigðum viðmiðunarhópum, 31 AsymAD einstaklingum og 33 AD einstaklingum. CSF eintak 2 inniheldur 147 viðmið og 150 AD sýni. Fjölsjúkdóma CSF afritunar 4 hópurinn innihélt 18 viðmiðunarsýni, 17 AD, 19 ALS, 13 PD og 11 FTD sýni. Samkvæmt samkomulaginu sem samþykkt var af Emory University Institutional Review Board fengu allir þátttakendur Emory rannsóknarinnar upplýst samþykki. Samkvæmt 2014 National Institute of Aging Best Practice Guidelines for Alzheimer's Centers (https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html), var heila- og mænuvökvi safnað og geymt með lendarstungum. Control og AsymAD og AD sjúklingar fengu staðlað vitræna mat á Emory Cognitive Neurology Clinic eða Goizueta ADRC. Heila- og mænuvökvasýni þeirra voru prófuð með INNO-BIA AlzBio3 Luminex fyrir ELISA Aβ1-42, heildar tau og p-tau greiningu (65). ELISA gildi eru notuð til að styðja við greiningarflokkun einstaklinga sem byggir á staðfestum AD lífmerkjaviðmiðum (66, 67). Lýðfræðilegar grunn- og greiningargögn fyrir aðrar CSF greiningar (FTD, ALS og PD) eru einnig fengnar frá Emory ADRC eða tengdum rannsóknarstofnunum. Yfirlitstilvikslýsigögn fyrir þessi Emory CSF tilfelli má finna í töflu S1A. Einkenni svissneska CSF afritunar 3 hópsins hafa áður verið birt (45).
CSF fann sýnið. Til að auka dýpt uppgötvunar okkar á CSF gagnasettinu var ónæmisneysla á próteinum í miklu magni framkvæmd fyrir trypsínvæðingu. Í stuttu máli voru 130 μl af CSF úr 40 einstökum CSF sýnum og jafnt rúmmál (130 μl) af High Select Top14 Abundance Protein Depletion Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372) sett í snúningssúlu (Thermo Fisher Scientific, A89868) í herberginu hitastig Incubate). Eftir að hafa snúist í 15 mínútur, skilið sýninu við 1000g í 2 mínútur. 3K útflótta síubúnaður (Millipore, UFC500396) var notaður til að þétta frárennslissýnið með skilvindu við 14.000g í 30 mínútur. Þynnið allt sýnismagn í 75 μl með fosfatbúðuðu saltvatni. Próteinstyrkurinn var metinn með bicinchoninic sýru (BCA) aðferðinni samkvæmt samskiptareglum framleiðanda (Thermo Fisher Scientific). Ónæmissnautt CSF (60 μl) úr öllum 40 sýnunum var melt með lýsýl endópeptíðasa (LysC) og trypsíni. Í stuttu máli var sýnið minnkað og alkýlerað með 1,2 μl 0,5 M tris-2(-karboxýetýl)-fosfíni og 3 μl 0,8 M klórasetamíði við 90°C í 10 mínútur og síðan hljóðblandað í vatnsbaði í 15 mínútur. Sýnið var þynnt með 193 μl 8 M þvagefnisbuffi [8 M þvagefni og 100 mM NaHPO4 (pH 8,5)] í lokastyrk upp á 6 M þvagefni. LysC (4,5 μg; Wako) er notað til meltingar yfir nótt við stofuhita. Sýnið var síðan þynnt í 1 M þvagefni með 50 mM ammóníumbíkarbónati (ABC) (68). Bætið við jöfnu magni (4,5 μg) af trypsíni (Promega) og ræktið síðan sýnið í 12 klukkustundir. Súrið meltuðu peptíðlausnina í lokastyrk 1% maurasýru (FA) og 0,1% tríflúorediksýru (TFA) (66), og afsalti síðan með 50 mg Sep-Pak C18 súlu (Waters) eins og lýst er hér að ofan (25) . Peptíðið var síðan skolað í 1 ml af 50% asetónítríl (ACN). Til að staðla próteinmagngreiningu yfir lotur (25), voru 100 μl skammtar úr öllum 40 CSF sýnunum sameinuð til að búa til blandað sýni, sem síðan var skipt í fimm alþjóðlega innri staðla (GIS) (48) sýni. Öll einstök sýni og samsettir staðlar eru þurrkaðir með háhraða lofttæmi (Labconco).
CSF afritar sýnishornið. Dayon og félagar hafa áður lýst ónæmisskemmdum og meltingu á CSF afriti 3 sýnum (45, 46). Hin endurteknu sýni sem eftir voru voru ekki ónæmisskemmd hvert fyrir sig. Meltu þessi ófjarlægðu sýni í trypsíni eins og áður hefur verið lýst (17). Fyrir hverja endurtekna greiningu voru 120 μl skammtar af skoluðu peptíðinu úr hverju sýni safnað saman og skipt í jafn stóra skammta til að nota sem TMT-merktur alþjóðlegur innri staðall (48). Öll einstök sýni og samsettir staðlar eru þurrkaðir með háhraða lofttæmi (Labconco). Til þess að auka merki CSF próteinsins sem er lítið magn, með því að sameina 125 μl úr hverju sýni, var útbúið „aukið“ sýni fyrir hverja endurtekna greiningu [þ.e. lífsýni sem líkir eftir rannsóknarsýninu, en magnið sem er tiltækt er miklu stærra (37, 69)] sameinað í blandað CSF sýni (17). Blandaða sýnið var síðan fjarlægt með ónæmi með því að nota 12 ml af High Select Top14 Abundance Protein Removal Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372), melt eins og lýst er hér að ofan og innifalið í síðari margfeldi TMT merkingu.
Birtingartími: 27. ágúst 2021