Þakka þér fyrir að heimsækja Nature.com. Vafraútgáfan sem þú notar hefur takmarkaðan CSS stuðning. Til að fá bestu upplifunina mælum við með því að þú notir uppfærðan vafra (eða slökkva á eindrægnistillingu í Internet Explorer). Í millitíðinni, til að tryggja áframhaldandi stuðning, munum við gera síðuna án stíla og JavaScript.
Hitafílar eru örverur sem þrífast við háan hita. Rannsókn á þeim getur veitt dýrmætar upplýsingar um hvernig lífið aðlagast erfiðum aðstæðum. Hins vegar er erfitt að ná háhitaskilyrðum með hefðbundnum ljóssmásjáum. Nokkrar heimagerðar lausnir byggðar á staðbundinni viðnámsrafhitun hafa verið lagðar fram, en það er engin einföld viðskiptalausn. Í þessari grein kynnum við hugmyndina um smáskala leysirhitun yfir sjónsvið smásjár til að veita háan hita fyrir hitakæra rannsóknir á sama tíma og umhverfi notandans er mildt. Hægt er að ná upphitun í smáskala við miðlungs leysistyrk með því að nota gullnanóagnahúðað undirlag sem lífsamhæft og skilvirkt ljósgleypni. Fjallað er um hugsanleg áhrif vökvasöfnunar í smáskala, frumusöfnun og miðflóttahitahreyfingu. Aðferðin hefur verið sýnd í tveimur tegundum: (i) Geobacillus stearothermophilus, virk hitakær baktería sem fjölgar sér við um 65°C, sem við höfum séð spíra, vaxa og synda við hita í smáskala; (ii) Thiobacillus sp., ákjósanlegur ofhitasækinn archaea. við 80°C. Þetta verk ryður brautina fyrir einfalda og örugga athugun á hitakærum örverum með því að nota nútímaleg og hagkvæm smásjártæki.
Á milljörðum ára hefur líf á jörðinni þróast til að laga sig að margvíslegum umhverfisaðstæðum sem stundum eru taldar öfgafullar frá okkar mannlegu sjónarhorni. Sérstaklega þrífast sumar hitakærar örverur (bakteríur, fornleifar, sveppir) sem kallast hitasæklingar á hitabilinu frá 45°C til 122°C1, 2, 3, 4. Hitakærar lífverur lifa í ýmsum vistkerfum, svo sem vatnshitaloftum í djúpsjávarum, hverum eða eldfjallasvæði. Rannsóknir þeirra hafa vakið mikinn áhuga undanfarna áratugi af að minnsta kosti tveimur ástæðum. Í fyrsta lagi getum við lært af þeim, til dæmis hvernig hitakæringar 5, 6, ensím 7, 8 og himnur 9 eru stöðugar við svo háan hita, eða hvernig hitakæringar þola mikla geislun10. Í öðru lagi eru þau grundvöllur margra mikilvægra líftæknilegra nota1,11,12 eins og eldsneytisframleiðslu13,14,15,16, efnasmíði (díhýdró, alkóhól, metan, amínósýrur osfrv.)17, lífnám18 og hitastöðugir lífhvatar7 ,11, 13. Einkum felur hin vel þekkta pólýmerasa keðjuverkun (PCR)19 í sér ensím (Taq pólýmerasi) sem er einangrað úr hitakæru bakteríunni Thermus aquaticus, einum af fyrstu hitasæklingunum sem uppgötvaðist.
Hins vegar er rannsókn á hitasæklingum ekki auðvelt verkefni og ekki hægt að impra á neinni líffræðilegri rannsóknarstofu. Sérstaklega er ekki hægt að sjá lifandi hitasæklinga in vitro með neinni venjulegri ljóssmásjá, jafnvel með upphitunarklefum sem fást í verslun, venjulega metin fyrir hitastig allt að 40°C. Frá því á tíunda áratugnum hafa aðeins fáir rannsóknarhópar helgað sig innleiðingu háhita smásjárkerfa (HTM). Árið 1994, Glukh o.fl. Upphitunar/kælihólfið var hugsað út frá því að nota Peltier frumu sem stjórnar hitastigi rétthyrndra háræða sem eru lokuð til að viðhalda loftfælni 20 . Hægt er að hita tækið upp í 100 °C á hraðanum 2 °C/s, sem gerir höfundum kleift að rannsaka hreyfanleika ofhitasæknu bakteríunnar Thermotoga maritima21. Árið 1999, Horn o.fl. Mjög svipað tæki hefur verið þróað, enn byggt á notkun upphitaðra háræða sem henta til smásjárskoðunar í atvinnuskyni til að rannsaka frumuskiptingu/tengingu. Eftir langt tímabil af hlutfallslegri aðgerðaleysi hófst leitin að áhrifaríkum HTM-tækjum aftur árið 2012, einkum í tengslum við röð greina frá Wirth hópnum sem notaði tæki sem fundið var upp af Horn o.fl. Fyrir 15 árum síðan var hreyfanleiki mikils fjölda forndýra, þar á meðal ofhitafæla, rannsakað við hitastig allt að 100°C með því að nota hituð háræða23,24. Þeir breyttu einnig upprunalegu smásjánni til að ná hraðari upphitun (nokkrar mínútur í stað 35 mínútna til að ná settu hitastigi) og ná fram línulegum hitastigli sem er meira en 2 cm yfir miðilinn. Þetta hitastigsmótunartæki (TGFD) hefur verið notað til að rannsaka hreyfanleika margra hitasækna innan hitastigs í líffræðilega viðeigandi fjarlægðum 24, 25 .
Upphitun á lokuðum háræðum er ekki eina leiðin til að fylgjast með lifandi hitakærum. Árið 2012, Kuwabara o.fl. Notuð voru heimagerð einnota Pyrex hólf innsigluð með hitaþolnu lími (Super X2; Cemedine, Japan). Sýnin voru sett á gagnsæja hitaplötu sem fæst í verslun (Micro Heat Plate, Kitazato Corporation, Japan) sem getur hitnað allt að 110°C, en ekki upphaflega ætlað til lífmyndatöku. Höfundarnir sáu skilvirka skiptingu loftfirrtra hitakærra baktería (Thermosipho globiformans, tvöföldunartími 24 mín) við 65°C. Árið 2020, Pulshen o.fl. Sýnt var fram á skilvirka upphitun á málmdiskum í atvinnuskyni (AttofluorTM, Thermofisher) með tveimur heimagerðum hitaeiningum: loki og stigi (PCR vél-innblásinn uppsetning). Þessi tenging leiðir til jafns vökvahita og kemur í veg fyrir uppgufun og þéttingu neðst á lokinu. Notkun O-hrings kemur í veg fyrir gasskipti við umhverfið. Þetta HTM, kallað Sulfoscope, var notað til að mynda Sulfolobus acidocaldarius við 75°C27.
Viðurkennd takmörkun allra þessara kerfa var takmörkunin á notkun loftmarkmiða, þar sem olíudýfing hentaði ekki fyrir svo háan hita og til að mynda í gegnum >1 mm þykk gagnsæ sýni. Viðurkennd takmörkun allra þessara kerfa var takmörkunin á notkun loftmarkmiða, þar sem olíudýfing hentaði ekki fyrir svo háan hita og til að mynda í gegnum >1 mm þykk gagnsæ sýni. Общепризнанным недостатком всех этих систем было ограничение на использование воздушных объектив, колектив е погружение в масло не подходило для такой высокой температуры и для визуализации через прозрачнцо 1. Viðurkenndur galli á öllum þessum kerfum var takmörkun á notkun loftmarkmiða, þar sem olíudýfing hentaði ekki fyrir svo háan hita og til að sjá í gegnum gagnsæ sýni > 1 mm þykk.所有这些系统的一个公认限制是限制使用空气物镜，任何油浸都限制是限制使用空气物镜，任何油浸都不适合踄口毫米厚的透明样品成像。 Viðurkennd takmörkun allra þessara kerfa er takmörkun þess að nota loftspegill, þar sem hvers kyns olíudýfing hentar ekki til að mynda gagnsæ sýni >1 mm þykk við svo háan hita. Общепризнанным недостатком всех этих систем является ограниченное использование воздушных объектин ружение в масло непригодно для таких высоких температур og визуализации через прозрачные образцы мобразцы мойн. Viðurkenndur galli allra þessara kerfa er takmörkuð notkun loftlinsa, hvers kyns olíudýfing hentar ekki fyrir svo háan hita og sjón í gegnum gagnsæ sýni >1 mm þykk.Nýlega var þessari takmörkun aflétt af Charles-Orzag o.fl. 28, sem þróaði tæki sem veitir ekki lengur hita í kringum kerfið sem vekur áhuga, heldur inni í hlífðarglerinu sjálfu, þakið þunnu gagnsæju lagi af viðnámi úr ITO (indium-tin oxíði). Hægt er að hita lokið upp í 75 °C með því að leiða rafstraum í gegnum gegnsæja lagið. Hins vegar verður höfundur einnig að hita linsuna upp að markmiðinu, þó ekki meira en 65 °C, til að skemma hana ekki.
Þessi verk sýna að þróun skilvirkrar háhita ljóssmásjár hefur ekki verið almennt tekin í notkun, oft þarf heimatilbúinn búnað og er oft náð á kostnað staðbundinnar upplausnar, sem er alvarlegur ókostur í ljósi þess að hitakærar örverur eru ekki stærri en nokkrar. míkrómetrar. Minnkað upphitunarrúmmál er lykillinn að því að leysa þrjú innbyggð vandamál HTM: léleg staðbundin upplausn, mikil hitatregða þegar kerfið hitnar og skaðleg hitun nærliggjandi þátta (ídýfiolíu, linsu linsu ... eða hendur notanda) við mikla hitastig. ).
Í þessari grein kynnum við HTM fyrir hitakæra athugun sem byggist ekki á viðnámshitun. Þess í stað náðum við staðbundinni hitun innan takmarkaðs svæðis í sjónsviði smásjáarinnar með leysigeislun á ljósgleypandi undirlagi. Dreifing hitastigs var sýnd með megindlegri fasasmásjá (QPM). Árangur þessarar aðferðar er sýndur af Geobacillus stearothermophilus, hreyfanlegri hitakærri bakteríu sem fjölgar sér við um 65°C og hefur stuttan tvöföldunartíma (um 20 mínútur), og Sulfolobus shibatae, ofhita sem vex best við 80°C (archaea) til að sýna. Eðlilegur afritunarhraði og sund sáust sem fall af hitastigi. Þessi leysir HTM (LA-HTM) takmarkast ekki af þykkt hyljarans eða eðli hlutarins (loft- eða olíudýfing). Þetta gerir kleift að nota hvaða linsu sem er með háupplausn á markaðnum. Það þjáist heldur ekki af hægum upphitun vegna hitatregðu (nær skyndilega hitun á millisekúndu mælikvarða) og notar aðeins íhluti sem eru fáanlegir í verslun. Einu nýju öryggisáhyggjurnar eru tengdar tilvist öflugra leysigeisla (venjulega allt að 100 mW) inni í tækinu og hugsanlega í gegnum augun, sem krefjast hlífðargleraugu.
Meginreglan í LA-HTM er að nota leysir til að hita sýnið staðbundið innan sjónsviðs smásjáarinnar (Mynd 1a). Til að gera þetta verður sýnið að vera ljósgleypið. Til að nota hæfilegan leysistyrk (minna en 100 mW) treystum við ekki á frásog ljóss af vökvamiðlinum, heldur aukum við frásog sýnisins tilbúnar með því að húða undirlagið með gullnanóögnum (mynd 1c). Upphitun gullnanóagna með ljósi er grundvallaratriði á sviði varma plasmonics, með væntanlegum notkunum í líflæknisfræði, nanóefnafræði eða sólarljósuppskeru29,30,31. Undanfarin ár höfum við notað þetta LA-HTM í nokkrum rannsóknum sem tengjast varma plasmanotkun í eðlisfræði, efnafræði og líffræði. Helsti erfiðleikinn við þessa aðferð er að sýna endanlegt hitastigssnið, þar sem hækkað hitastig er takmarkað við smáskala svæði innan sýnisins. Við höfum sýnt fram á að hægt er að ná hitakortlagningu með fjögurra bylgjulengda þverskurðarvíxlmælinum, einfaldri, hárri upplausn og mjög næmri aðferð við megindlega fasasmásjárskoðun sem byggir á notkun tvívíddar sveigjurita (einnig þekkt sem krossrist) 33,34,35,36. Sýnt hefur verið fram á áreiðanleika þessarar hitasmásjártækni, sem byggir á krossgrind bylgjusviðssmásjár (CGM), í tugi greina sem gefin hafa verið út undanfarinn áratug37,38,39,40,41,42,43.
Áætlun um uppsetningu á samhliða leysirhitun, mótun og hitasmásjá. b Rúmfræði sýnis sem samanstendur af AttofluorTM hólfi sem inniheldur hylki sem er húðað með gylltum nanóögnum. c Skoðaðu sýnishornið vel (ekki í mælikvarða). d táknar samræmda leysigeislasniðið og (e) eftirlíka hitadreifingu í kjölfarið á sýnisfleti gullnanóagnanna. f er hringlaga leysigeislasnið sem hentar til að mynda einsleitt hitastig eins og sýnt er í líkingu á hitadreifingu sem myndast sem sýnd er í (g). Mælikvarðarstöng: 30 µm.
Sérstaklega náðum við nýlega upphitun spendýrafrumna með LA-HTM og CGM og fylgjumst með hitalostssvörun frumna á bilinu 37-42°C, sem sýnir fram á notagildi þessarar tækni á myndgreiningu á einni lifandi frumu. Hins vegar er notkun LA-HTM til rannsókna á örverum við háan hita ekki ótvíræð, þar sem það krefst meiri varúðar miðað við spendýrafrumur: í fyrsta lagi leiðir hitun botns miðilsins um tugi gráður (frekar en nokkrar gráður) í sterkan lóðréttan hitastig. getur búið til vökvavökvun 44 sem getur valdið óæskilegri hreyfingu og blöndun baktería ef hún er ekki þétt fest við undirlagið. Hægt er að útrýma þessari suðu með því að minnka þykkt vökvalagsins. Í þessum tilgangi, í öllum tilraununum sem kynntar eru hér að neðan, voru bakteríusviflausnir settar á milli tveggja um það bil 15 µm þykkra hylkja sem settir voru inn í málmbikar (AttofluorTM, Thermofisher, mynd 1b, c). Í grundvallaratriðum er hægt að forðast convection ef þykkt vökvans er minni en geislastærð hitunarleysisins. Í öðru lagi, að vinna í svo takmarkaðri rúmfræði getur kæft loftháðar lífverur (sjá mynd S2). Hægt er að koma í veg fyrir þetta vandamál með því að nota undirlag sem er gegndræpt fyrir súrefni (eða öðrum lífsnauðsynlegum gasi), með því að skilja eftir fastar loftbólur inni í hyljaranum eða með því að bora göt í efri hyljarann (sjá mynd S1) 45 . Í þessari rannsókn völdum við síðari lausnina (myndir 1b og S1). Að lokum veitir leysirhitun ekki samræmda hitadreifingu. Jafnvel við sama styrkleika leysigeislans (Mynd 1d) er hitadreifingin ekki jöfn heldur líkist Gaussdreifingunni vegna varmadreifingar (Mynd 1e). Þegar markmiðið er að koma á nákvæmu hitastigi á sjónsviðinu til að rannsaka líffræðileg kerfi eru ójöfn snið ekki tilvalin og geta einnig leitt til hitafælna hreyfingar baktería ef þær festast ekki við undirlagið (sjá mynd S3, S4)39. Í þessu skyni notuðum við rýmisljósmótara (SLM) til að móta innrauða leysigeislann í samræmi við lögun hringsins (mynd 1f) í plani sýnisins til að ná fullkomlega jafnri hitadreifingu innan tiltekins rúmfræðilegs svæðis, þrátt fyrir hitadreifingu (Mynd 1d) 39, 42, 46. Settu topplok yfir málmdisk (Mynd 1b) til að forðast uppgufun miðilsins og fylgstu með í að minnsta kosti nokkra daga. Vegna þess að þessi toppur er ekki lokaður er auðvelt að bæta við viðbótarmiðli hvenær sem er ef þörf krefur.
Til að sýna hvernig LA-HTM virkar og sýna fram á notagildi þess í hitakærum rannsóknum, rannsökuðum við loftháðu bakteríurnar Geobacillus stearothermophilus, sem hafa ákjósanlegan vaxtarhita um 60-65°C. Bakterían hefur einnig flagellur og hæfileika til að synda, sem gefur enn einn vísbendingu um eðlilega frumuvirkni.
Sýni (Mynd 1b) voru forræktuð við 60°C í eina klukkustund og síðan sett í LA-HTM sýnishaldara. Þessi forræktun er valfrjáls, en samt gagnleg, af tveimur ástæðum: Í fyrsta lagi, þegar kveikt er á leysinum, veldur það því að frumurnar vaxa strax og skipta sér (sjá kvikmynd M1 í Supplementary Materials). Án forræktunar seinkar bakteríuvexti venjulega um 40 mínútur í hvert sinn sem nýtt útsýnissvæði er hitað á sýninu. Í öðru lagi stuðlaði 1 klst. forræktunin við að bakteríurnar festi sig við hyljarann, og kom í veg fyrir að frumur reki út fyrir sjónsviðið vegna hitaupptöku þegar kveikt var á leysinum (sjá kvikmynd M2 í viðbótarefni). Thermophoresis er hreyfing agna eða sameinda eftir hitastigli, venjulega frá heitu til kalt, og eru bakteríur engin undantekning43,47. Þessum óæskilegu áhrifum er útrýmt á tilteknu svæði með því að nota SLM til að móta leysigeislann og ná flatri hitadreifingu.
Á mynd. Mynd 2 sýnir hitadreifinguna sem mæld er með CGM sem fæst með því að geisla undirlag úr gleri sem er húðað með gullnanóögnum með hringlaga leysigeisla (mynd 1f). Fljótleg hitadreifing sást yfir allt svæðið sem leysigeislinn náði. Þetta svæði var stillt á 65°C, ákjósanlegur vaxtarhiti. Utan þessa svæðis fellur hitaferillinn náttúrulega niður í \(1/r\) (þar sem \(r\) er geislahnit).
hitakort af CGM-mælingum sem fæst með því að nota hringlaga leysigeisla til að geisla lag af gullnanóögnum til að fá flatt hitastig yfir hringlaga svæði. b Jafnhiti hitakortsins (a). Útlínur leysigeislans eru táknaðar með gráum punktahring. Tilraunin var endurtekin tvisvar (sjá viðbótarefni, mynd S4).
Fylgst var með lífvænleika bakteríufrumna í nokkrar klukkustundir með LA-HTM. Á mynd. 3 sýnir tímabilið fyrir fjórar myndir teknar úr 3 klukkustunda 20 mínútna kvikmynd (Movie M3, viðbótarupplýsingar). Í ljós kom að bakteríur fjölguðu sér með virkum hætti innan hringlaga svæðisins sem skilgreint er af leysinum þar sem hitastigið var ákjósanlegt, nálgast 65°C. Aftur á móti minnkaði frumuvöxtur verulega þegar hitastigið fór niður fyrir 50°C í 10 s.
Ljósdýptarmyndir af G. stearothermophilus bakteríum sem vaxa eftir laserhitun á mismunandi tímum, (a) t = 0 mín, (b) 1 klst 10 mín, (c) 2 klst 20 mín, (d) 3 klst 20 mín, út af 200 Unnið úr einnar mínútu filmu (M3 filma veitt í viðbótarupplýsingum) sem er ofan á samsvarandi hitakort. Laserinn kviknar á tímanum \(t=0\). Jafnhitum hefur verið bætt við styrkleikamyndina.
Til að mæla frekar frumuvöxt og háð hitastigi, mældum við aukningu á lífmassa ýmissa nýlendna af upphaflega einangruðum bakteríum í Movie M3 sjónsviðinu (mynd 4). Móðurbakteríurnar sem voru valdar í upphafi mCFU-myndunar eru sýndar á mynd S6. Þurrmassamælingar voru teknar með CGM 48 myndavél sem notuð var til að kortleggja hitadreifingu. Hæfni CGM til að mæla þurrþyngd og hitastig er styrkur LA-HTM. Eins og við var að búast olli hár hiti hraðari bakteríuvöxt (mynd 4a). Eins og sýnt er í hálf-log lóðinni á mynd 4b, fylgir vöxtur við öll hitastig veldisvexti, þar sem gögnin nota veldisfallið \(m={m}_{0}{10}^{t/\ tau }+ {{ \mbox{cst}}}\), þar sem \(\tau {{{{{\rm{log }}}}}}2\) – kynslóðatími (eða tvöföldunartími), \( g =1/ \tau\) – vaxtarhraði (fjöldi deilda á tímaeiningu ). Á mynd. 4c sýnir viðkomandi vaxtarhraða og kynslóðartíma sem fall af hitastigi. Hratt vaxandi mCFU einkennist af mettun vaxtar eftir tvær klukkustundir, væntanleg hegðun vegna mikillar bakteríuþéttleika (svipað og kyrrstöðufasinn í klassískum vökvaræktun). Almenna lögunin \(g\left(T\right)\) (Mynd 4c) samsvarar væntanlegum tveggja fasa ferli fyrir G. stearothermophilus með ákjósanlegum vaxtarhraða um 60-65°C. Passaðu gögnin með því að nota aðallíkan (Mynd S5)49 þar sem \(\left({{G}_{0}{;\;T}}_{{\min }};{T}_{{opt} } ;{T}_{{\max}}\right)\) = (0,70 ± 0,2; 40 ± 4; 65 ± 1,6; 67 ± 3) °C, sem passar vel við önnur gildi sem vitnað er til í bókmenntum49. Þrátt fyrir að hægt sé að endurtaka hitaháðar færibreytur, getur hámarksvöxtur \({G}_{0}\) verið breytilegur frá einni tilraun til annarrar (sjá myndir S7-S9 og kvikmynd M4). Öfugt við færibreytur fyrir hitastigsfestingu, sem ættu að vera alhliða, fer hámarksvaxtarhraði eftir eiginleikum miðilsins (framboð næringarefna, súrefnisstyrkur) innan örskala rúmfræðinnar.
a Örveruvöxtur við mismunandi hitastig. mCFU: Miniature Colony Forming Units. Gögn fengin úr myndbandi af einni bakteríu sem vex í hitastigi (mynd M3). b Sama og (a), hálflogaritmískur kvarði. c Vaxtarhraði\(\tau\) og kynslóðatími\(g\) reiknaður út frá línulegri aðhvarf (b). Láréttir villustikur: hitastig sem mCFU stækkaði yfir í sjónsviðið við vöxt. Lóðréttar villustikur: Línuleg aðhvarfsstaðavilla.
Auk eðlilegs vaxtar komu sumar bakteríur stundum fram á sjónarsviðið við laserhitun, sem er væntanleg hegðun fyrir bakteríur með flagellur. Kvikmyndin M5 í viðbótarupplýsingum sýnir slíka sundstarfsemi. Í þessari tilraun var samræmd leysigeislun notuð til að búa til hitastig, eins og sýnt er á myndum 1d, e og S3. Mynd 5 sýnir tvær myndaraðir valdar úr M5 kvikmyndinni sem sýna að ein baktería sýnir stefnuhreyfingu á meðan allar aðrar bakteríur eru hreyfingarlausar.
Tímarammarnir tveir (a) og (b) sýna sund tveggja mismunandi baktería merktar með punktuðum hringjum. Myndirnar voru unnar úr M5 kvikmyndinni (veittar sem viðbótarefni).
Í tilfelli G. stearothermophilus hófst virk hreyfing baktería (mynd 5) nokkrum sekúndum eftir að kveikt var á leysigeislanum. Þessi athugun leggur áherslu á tímabundin viðbrögð þessarar hitakæru örveru við hækkun á hitastigi, eins og þegar sést af Mora o.fl. 24 . Hægt er að kanna efnið hreyfanleika baktería og jafnvel hitataxi frekar með LA-HTM.
Ekki ætti að rugla saman örverusundi við aðrar tegundir líkamlegrar hreyfingar, nefnilega (i) Brownísk hreyfing, sem virðist vera óskipuleg hreyfing án ákveðinnar stefnu, (ii) convection 50 og thermophoresis 43, sem felst í reglulegri hreyfingu meðfram hitastigi. halli.
G. stearothermophilus er þekktur fyrir getu sína til að framleiða mjög ónæm gró (grómyndun) þegar hann verður fyrir skaðlegum umhverfisaðstæðum sem vörn. Þegar umhverfisaðstæður verða hagstæðar aftur spíra gróin, mynda lifandi frumur og hefja vöxt á ný. Þó að þetta grómyndun/spírunarferli sé vel þekkt hefur það aldrei sést í rauntíma. Með því að nota LA-HTM greinum við hér frá fyrstu athuguninni á spírunartilvikum í G. stearothermophilus.
Á mynd. 6a sýnir tímaskekkjumyndir af sjónrænum dýpt (OT) fengnar með því að nota CGM sett af 13 gróum. Í allan söfnunartímann (15 klst. 6 mín., \(t=0\) – upphaf leysirhitunar), spíruðu 4 af 13 gróum, á röð \(t=2\) klst., \( 3\ ) h \(10 \)', \(9\) h \(40\)' og \(11\) h \(30\)'. Þó að aðeins einn af þessum atburðum sé sýndur á mynd 6, má sjá 4 spírunartilvik í M6 myndinni í viðbótarefninu. Athyglisvert er að spírun virðist vera tilviljunarkennd: ekki öll gró spíra og spíra ekki á sama tíma, þrátt fyrir sömu breytingar á umhverfisaðstæðum.
a Time-lapse sem samanstendur af 8 OT myndum (olíudýfing, 60x, 1,25 NA markmið) og (b) lífmassaþróun af G. stearothermophilus efnasamböndum. c (b) Teiknuð á hálf-log mælikvarða til að undirstrika línuleika vaxtarhraðans (stutt lína).
Á mynd. 6b,c sýnir lífmassa frumustofna á sjónsviðinu sem fall af tíma yfir allt gagnasöfnunartímabilið. Hröð hrörnun þurrmassans sem sést við \(t=5\)h á mynd. 6b, c, vegna útgöngu sumra frumna úr sjónsviðinu. Vaxtarhraði þessara fjögurra atburða er \(0,77\pm 0,1\) h-1. Þetta gildi er hærra en vaxtarhraðinn sem tengist mynd 3. 3 og 4, þar sem frumur vaxa eðlilega. Ástæðan fyrir auknum vaxtarhraða G. stearothermophilus úr gróum er óljós, en þessar mælingar sýna áhuga LA-HTM og vinna á stakfrumustigi (eða á stakri mCFU stigi) til að læra meira um gangverk frumulífs .
Til að sýna enn frekar fram á fjölhæfni LA-HTM og frammistöðu þess við háan hita, skoðuðum við vöxt Sulfolobus shibatae, ofhitasækinnar sýrusækinnar forndýra með ákjósanlegasta vaxtarhita upp á 80°C51. Í samanburði við G. stearothermophilus hafa þessar archaea einnig mjög mismunandi formgerð og líkjast 1 míkron kúlum (kokkum) frekar en ílangum stöfum (bacilli).
Mynd 7a samanstendur af raðmyndum af sjónrænum dýptarmyndum af S. shibatae mCFU sem fengust með því að nota CGM (sjá M7 leikin kvikmynd í Supplementary Materials). Þessi mCFU vex við um 73°C, undir kjörhitastigi 80°C, en innan hitastigssviðsins fyrir virkan vöxt. Við horfðum á marga klofnaatburði sem létu mCFU líta út eins og örþrúgur fornaldna eftir nokkrar klukkustundir. Frá þessum OT myndum var mCFU lífmassi mældur með tímanum og sýndur á mynd 7b. Athyglisvert er að S. shibatae mCFUs sýndu línulegan vöxt frekar en veldisvöxt sem sést með G. stearothermophilus mCFUs. Það hefur verið löng umræða 52 um eðli frumuvaxtarhraða: á meðan sumar rannsóknir greina frá vaxtarhraða örvera sem er í réttu hlutfalli við stærð þeirra (veldisvísisvöxtur), aðrar sýna stöðugan hraða (línulegur eða tvílínulegur vöxtur). Eins og útskýrt er af Tzur o.fl.53, þarf að greina á milli veldisvísis og (tví)línulegs vaxtar nákvæmni upp á <6% í lífmassamælingum, sem er utan seilingar fyrir flestar QPM tækni, jafnvel með víxlmælingum. Eins og útskýrt er af Tzur o.fl.53, þarf að greina á milli veldisvísis og (tví)línulegs vaxtar nákvæmni upp á <6% í lífmassamælingum, sem er utan seilingar fyrir flestar QPM tækni, jafnvel með víxlmælingum. Цур и др.53, различение экспоненциального og (e.) достижимо для большинства методов QPM, даже с использованием интерферометрии. Eins og útskýrt er af Zur o.fl.53, þarf að greina á milli veldisvísis og (tví)línulegs vaxtar <6% nákvæmni í lífmassamælingum, sem er óviðunandi fyrir flestar QPM aðferðir, jafnvel með því að nota víxlmælingar.Eins og útskýrt er af Zur o.fl. 53, til að greina á milli veldisvísis og (tví)línulegs vaxtar þarf minna en 6% nákvæmni í lífmassamælingum, sem er óviðunandi fyrir flestar QPM aðferðir, jafnvel þegar interferometry er notað. CGM nær þessari nákvæmni með undir-pg nákvæmni í lífmassamælingum36,48.
a Time-lapse sem samanstendur af 6 OT myndum (olíudýfing, 60x, NA markmið 1,25) og (b) þróun ör-CFU lífmassa mæld með CGM. Sjá kvikmynd M7 fyrir frekari upplýsingar.
Fullkomlega línulegur vöxtur S. shibatae var óvæntur og hefur ekki enn verið greint frá því. Hins vegar er búist við veldisvexti, að minnsta kosti vegna þess að með tímanum verða margar skiptingar 2, 4, 8, 16 ... frumna að eiga sér stað. Við gerðum þá tilgátu að línulegur vöxtur gæti stafað af frumuhömlun vegna þéttrar frumupakkninga, rétt eins og frumuvöxtur hægir á og nær að lokum sofandi ástandi þegar frumuþéttleiki er of mikill.
Við lokum með því að ræða eftirfarandi fimm áhugaverða punkta aftur á móti: minnkun á upphitunarrúmmáli, minnkun á hitatregðu, áhuga á nanóögnum úr gulli, áhuga á megindlegri fasasmásjárskoðun og mögulegt hitasvið þar sem hægt er að nota LA-HTM.
Í samanburði við viðnámshitun býður leysirhitun sem notuð er við HTM þróun nokkra kosti, sem við sýnum í þessari rannsókn. Sérstaklega, í fljótandi miðli á sjónsviði smásjáarinnar, er upphitunarrúmmálinu haldið innan nokkurra (10 μm) 3 binda. Þannig eru aðeins þær örverur sem sést hafa virkar á meðan aðrar bakteríur liggja í dvala og hægt er að nota þær til að rannsaka sýnið frekar – það er engin þörf á að skipta um sýni í hvert sinn sem þarf að athuga nýtt hitastig. Að auki gerir upphitun á örskala kleift að skoða mikið hitastig: Mynd 4c var fengin úr 3 tíma kvikmynd (Movie M3), sem venjulega krefst undirbúnings og skoðunar á nokkrum sýnum – eitt fyrir hvert sýni sem verið er að rannsaka. y er hitastigið sem táknar fjölda daga í tilrauninni. Með því að minnka upphitaða rúmmálið haldast allir sjónrænir þættir smásjáarinnar í kring, sérstaklega hlutlinsuna, við stofuhita, sem hefur verið stórt vandamál sem samfélagið hefur staðið frammi fyrir hingað til. LA-HTM er hægt að nota með hvaða linsu sem er, þar með talið olíudýfingarlinsur, og haldast við stofuhita jafnvel við mikla hitastig í sjónsviðinu. Helstu takmörkun leysihitunaraðferðarinnar sem við greinum frá í þessari rannsókn er að frumur sem ekki festast eða fljóta geta verið langt frá sjónsviðinu og erfitt að rannsaka. Lausn gæti verið að nota linsur með lítilli stækkun til að ná meiri hitahækkun umfram nokkur hundruð míkron. Þessari varkárni fylgir minnkun á rýmisupplausn, en ef markmiðið er að rannsaka hreyfingu örvera er ekki þörf á mikilli rýmisupplausn.
Tímakvarðinn fyrir upphitun (og kælingu) kerfisins \({{{{\rm{\tau }}}}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}\) fer eftir stærð þess, samkvæmt lögum \({{{({\rm{\tau }}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}={L}^{2}/D\), þar sem \ (L\ ) er einkennandi stærð hitagjafans (þvermál leysigeislans í rannsókn okkar er \(L\ um 100\) μm), \(D\) er hitadreifing umhverfisins (meðaltal í okkar mál, gler og vatn Dreifingarhraði\(D\ um það bil 2\falt {10}^{-7}\) m2/s Þess vegna, í þessari rannsókn, tímasvörun af stærðargráðunni 50 ms, þ.e. nánast samstundis). Búast má við hitabreytingum. Þessi tafarlausa stofnun hitastigs styttir ekki aðeins lengd tilraunarinnar, heldur gerir það einnig kleift að tímasetja nákvæma tímasetningu fyrir hvers kyns kraftmikla rannsókn á hitaáhrifum.
Fyrirhuguð aðferð okkar á við um hvaða ljósdrepandi undirlag sem er (til dæmis sýni í atvinnuskyni með ITO húðun). Hins vegar geta gull nanóagnir veitt mikið frásog í innrauða og lágt frásog á sýnilegu sviðinu, síðarnefndu eiginleikar þeirra eru áhugaverðir fyrir skilvirka sjónræna athugun á sýnilegu sviðinu, sérstaklega þegar flúrljómun er notuð. Að auki er gull lífsamhæft, efnafræðilega óvirkt, hægt er að stilla sjónþéttleika frá 530 nm í nálægt innrauða og sýnishornsgerð er einföld og hagkvæm29.
Þverrist bylgjuframsmásjá (CGM) gerir ekki aðeins kleift að kortleggja hitastig á smáskala, heldur einnig lífmassavöktun, sem gerir það sérstaklega gagnlegt (ef ekki þarf) í samsettri meðferð með LA-HTM. Undanfarinn áratug hefur önnur hitasmásjártækni verið þróuð, sérstaklega á sviði lífmyndagerðar, og flestar þeirra krefjast notkunar á hitanæmum flúrlýsandi rannsaka54,55. Þessar aðferðir hafa hins vegar verið gagnrýndar og sumar skýrslur hafa mælt óraunhæfar hitabreytingar innan frumna, hugsanlega vegna þess að flúrljómun er háð mörgum öðrum þáttum en hitastigi. Að auki eru flestar flúrljómunarnemar óstöðugir við háan hita. Þess vegna táknar QPM og sérstaklega CGM tilvalin hitasmásjártækni til að rannsaka líf við háan hita með ljóssmásjá.
Rannsóknir á S. shibatae, sem lifa best við 80°C, sýna að hægt er að beita LA-HTM til að rannsaka ofhitafíla, ekki bara einfalda hitakæra. Í grundvallaratriðum eru engin takmörk fyrir hitastigi sem hægt er að ná með LA-HTM, og jafnvel hitastig yfir 100°C er hægt að ná við loftþrýsting án suðu, eins og fram kemur af hópi okkar 38 í vatnshitaefnafræði við andrúmsloft. þrýstingur A. Laser er notaður til að hita gull nanóagnir 40 á sama hátt. Þannig hefur LA-HTM tilhneigingu til að nota til að fylgjast með áður óþekktum ofhitafílum með stöðluðum ljóssmásjá með háum upplausn við staðlaðar aðstæður (þ.e. við umhverfisálag).
Allar tilraunir voru gerðar með heimagerðri smásjá, þar á meðal Köhler lýsingu (með LED, M625L3, Thorlabs, 700 mW), sýnishaldara með handvirkri xy hreyfingu, markmiðum (Olympus, 60x, 0,7 NA, loft, LUCPlanFLN60X eða 60x, Oil NA, 1,25 NA , UPLFLN60XOI), CGM myndavél (QLSI krossgrind, 39 µm hæð, 0,87 mm frá Andor Zyla myndavélarskynjara) til að veita styrkleika og bylgjusviðsmyndatöku, og sCMOS myndavél (ORCA Flash 4.0 V3, 16 bita stilling, frá Hamamatsu) til að taka upp gögn sýnd á mynd 5 (bakteríusund). Tvíkroíski geislaskiptarinn er 749 nm BrightLine brún (Semrock, FF749-SDi01). Sían framan á myndavélinni er 694 stuttpassasía (FF02-694/SP-25, Semrock). Títansafír leysir (Laser Verdi G10, 532 nm, 10 W, dælt tsunami leysir hola, Spectra-Eðlisfræði á mynd 2-5, frekar skipt út fyrir Millenia leysir, Spectraphysics 10 W, dælt Mira leysir hola, Coherent, fyrir mynd 2 -5). 6 og 7) eru stillt á bylgjulengdina \({{{({\rm{\lambda }}}}}}=800\) nm, sem samsvarar plasmonresonance litróf gullnanóagna. Staðbundin ljósmótarar (1920 × 1152 pixlar) voru keyptir frá Meadowlark Optics. Heilmyndirnar voru reiknaðar út með Gerchberg-Saxton reikniritinu eins og lýst er í hlekknum 39.
Cross grating wavefront microscopy (CGM) er ljóssmásjártækni sem byggir á því að sameina tvívítt diffraction rist (einnig þekkt sem cross grating) í eins millimetra fjarlægð frá skynjara hefðbundinnar myndavélar. Algengasta dæmið um CGM sem við höfum notað í þessari rannsókn er kallað fjögurra bylgjulengdar þverskips víxlmælir (QLSI), þar sem krossgrindin samanstendur af styrkleika/fasa skákborðsmynstri kynnt og einkaleyfi á Primot o.fl. árið 200034. Lóðréttu og láréttu ristlínurnar búa til rist-líka skugga á skynjaranum, sem hægt er að vinna tölulega úr bjöguninni í rauntíma til að fá ljósbylgjusviðsbjögun (eða samsvarandi fasasnið) innfallsljóssins. Þegar CGM myndavél er notuð í smásjá getur hún sýnt ljósleiðarmun myndefnis, einnig þekktur sem sjónræn dýpt (OT), með næmni í stærðargráðunni nanómetrar36. Í öllum CGM-mælingum, til að koma í veg fyrir galla í sjónhlutum eða geislum, verður að taka aðalviðmiðunar-OT-mynd og draga hana frá öllum síðari myndum.
Hitastigssmásjárskoðun var gerð með CGM myndavél eins og lýst er í tilvísuninni. 32. Í stuttu máli, upphitun vökva breytir brotstuðul hans og skapar hitauppstreymi linsuáhrif sem skekkir innfallsgeislann. Þessi bylgjusviðsbjögun er mæld af CGM og unnin með afslöppunaralgrími til að fá þrívíddar hitadreifingu í fljótandi miðlinum. Ef gullnanóagnirnar dreifast jafnt um sýnið er hægt að gera hitakortlagningu á bakteríulausum svæðum til að framleiða betri myndir, sem við gerum stundum. Tilvísunar CGM myndin var tekin án upphitunar (með slökkt á leysinum) og síðan tekin á sama stað á myndinni með leysirinn á.
Mæling á þurrmassa er náð með því að nota sömu CGM myndavélina sem notuð er við hitamyndatöku. CGM viðmiðunarmyndir voru fengnar með því að færa sýnishornið hratt í x og y meðan á útsetningu stóð sem leið til að meðaltala hvers kyns ósamræmi í OT vegna nærveru baktería. Úr OT myndum af bakteríum var lífmassi þeirra fenginn með því að nota samsafn mynda yfir svæði sem valin voru með heimatilbúnu skiptingaralgrími Matlab (sjá undirkafla „Talakóði“), eftir aðferðinni sem lýst er í tilvísun. 48. Í stuttu máli notum við venslin \(m={\alpha}^{-1}\iint {{\mbox{OT}}}\left(x,y\right){{\mbox{d}} } x{{\mbox{d}}}y\), þar sem \({{\mbox{OT}}}\left(x,y\right)\) er ljósdýptarmyndin, \(m\) er þurrþyngdin og \({{{{{\rm{\alpha }}}}}}\) er fasti. Við völdum \({{{{\rm{\alpha))))))=0.18\) µm3/pg, sem er dæmigerður fasti fyrir lifandi frumur.
Hlífðarmiði 25 mm í þvermál og 150 µm þykkt húðaður með gullnanóögnum var settur í AttofluorTM hólf (Thermofisher) með gullnanóagnirnar upp. Geobacillus stearothermophilus var forræktaður yfir nótt í LB miðli (200 rpm, 60°C) fyrir hvern tilraunadag. Dropi af 5 µl af sviflausn af G. stearothermophilus með ljósþéttni (OD) frá 0,3 til 0,5 var settur á hylki með gylltum nanóögnum. Síðan var hringlaga þekjumiði 18 mm í þvermál með 5 mm í þvermál gat í miðjunni sett á dropann og 5 μl af bakteríusviflausn með sama sjónþéttleika var endurtekið sett á miðju gatsins. Brunnarnir á hyljara voru útbúnir í samræmi við aðferðina sem lýst er í sk. 45 (sjá viðbótarupplýsingar fyrir frekari upplýsingar). Bætið síðan 1 ml af LB miðli við hyljarann til að koma í veg fyrir að vökvalagið þorni. Síðasti hyljarinn er settur yfir lokað lok Attofluor™ hólfsins til að koma í veg fyrir uppgufun miðilsins meðan á ræktun stendur. Við spírunartilraunir notuðum við gró sem, eftir hefðbundnar tilraunir, þektu stundum toppinn. Svipuð aðferð var notuð til að fá Sulfolobus shibatae. Þrír dagar (200 rpm, 75°C) af forræktun Thiobacillus serrata voru framkvæmdar í miðli 182 (DSMZ).
Sýnishorn af nanóögnum úr gulli voru unnin með steinþurrku með micellar blokk samfjölliða lithography. Þessu ferli er lýst í smáatriðum í kap. 60. Í stuttu máli voru míslur sem umlykja gulljónir myndaðar með því að blanda samfjölliðunni við HAuCl4 í tólúeni. Hreinsuðum hyljaranum var síðan sökkt í lausnina og meðhöndluð með UV-geislun í viðurvist afoxunarefnis til að fá gullfræ. Að lokum voru gullfræ ræktuð með því að snerta hyljara við vatnslausn af KAuCl4 og etanólamíni í 16 mínútur, sem leiddi til hálftímabundins og mjög einsleitrar uppröðunar á nanóögnum sem ekki eru kúlulaga í nær innrauða.
Til að umbreyta interferograms í OT myndir, notuðum við heimatilbúið reiknirit, eins og lýst er í hlekknum. 33 og er fáanlegur sem Matlab pakki í eftirfarandi opinberu geymslu: https://github.com/baffou/CGMprocess. Pakkinn getur reiknað út styrkleika og OT myndir byggt á skráðum víxlum (þar á meðal viðmiðunarmyndum) og fjarlægðum myndavélar.
Til að reikna út fasamynstrið sem notað er á SLM til að fá tiltekið hitastig, notuðum við áður þróað heimatilbúið reiknirit39,42 sem er fáanlegt í eftirfarandi opinberu geymslu: https://github.com/baffou/SLM_temperatureShaping. Inntakið er hitastigið sem óskað er eftir, sem hægt er að stilla stafrænt eða með einlita bmp mynd.
Til að skipta frumunum og mæla þurrþyngd þeirra, notuðum við Matlab reikniritið okkar sem birt var í eftirfarandi opinberu geymslu: https://github.com/baffou/CGM_magicWandSegmentation. Á hverri mynd verður notandinn að smella á bakteríurnar eða mCFU sem vekur áhuga, stilla næmni sprotanna og staðfesta valið.
Fyrir frekari upplýsingar um hönnun náms, sjá ágrip náttúrurannsóknaskýrslu sem tengist þessari grein.
Gögn sem styðja niðurstöður þessarar rannsóknar eru fáanleg hjá viðkomandi höfundum ef sanngjarnt er óskað.
Frumkóði sem notaður er í þessari rannsókn er ítarlega í kaflanum Aðferðir og hægt er að hlaða niður kembiútgáfum frá https://github.com/baffou/ í eftirfarandi geymslum: SLM_temperatureShaping, CGMprocess og CGM_magicWandSegmentation.
Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Innsýn í hitakæra og breitt litrófsnotkun þeirra. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Innsýn í hitakæra og breitt litrófsnotkun þeirra.Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. og Sharma, AK Yfirlit yfir hitakæra og víðtæka notkun þeirra. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK 深入了解嗜热菌及其广谱应用。 Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK.Mehta R., Singhal P., Singh H., Damle D. og Sharma AK Djúpur skilningur á hitasæklum og fjölbreyttu notkunarsviði.3 Líftækni 6, 81 (2016).
Birtingartími: 26. september 2022